红外热像扫描技术在组织工程皮肤移植修复中的应用

目的　探索红外热像扫描技术在组织工程皮肤移植修复中应用的可能性。方法　在组织工程皮肤对大面积皮肤缺损动物 (裸鼠 )进行移植修复的不同时间 ,应用红外热像扫描仪对移植修复区进行动态观察。结果　在移植术后第 7天 ,热像图上移植区与正常皮肤温差明显 (>0 7℃ ) ;在移植的第 14天 ,移植区与周围正常皮肤的温差变小(<0 3℃ ) ;在移植的第 2 1天 ,移植区与正常皮肤无明显区别 ,温度几乎没有差别 (<0 1℃ )。预示着移植区的血运、代谢情况与正常皮肤差别不大 ,移植区有毛细血管长入、营养供应充足。结论　在应用组织工程皮肤进行皮肤缺损的移植修复时 ,可以应用红外热像扫描技术对移植修复的效果进行动态观察 ,监测毛细血管的生成情况、血运状况以及移植的组织工程皮肤与宿主皮肤的融合情况。     

应用改性聚乳酸构建复层组织工程皮肤的可行性研究

目的：以改性聚乳酸为细胞外基质网架,探索利用其构建复层组织工程皮肤的可行性。方法：取出生24 h以内的Wistar大鼠背部皮肤,以Dispase-trypsin双酶消化分离培养表皮角质形成细胞;以Ⅰ型胶原酶消化分离培养真皮成纤维细胞。采用盐析法制备机械性能得到部分改进的聚乳酸多孔泡沫支架,向支架接种真皮成纤维细胞（密度为3.0×10⁵cell•mL^-1）和表皮角质形成细胞（密度为5.0×10⁵cell•mL^-1）,体外培养1周,构建复层组织工程皮肤,并取培养的皮肤进行切片检测。结果：复层组织工程皮肤在结构上与正常皮肤相似,具有真皮、表皮双层结构。改性聚乳酸网架上有双层细胞生长,生长的细胞与网架接触,并且在其表面形成较为明显而连续的细胞层。结论：双醛淀粉作为良好的增柔剂在改善聚乳酸网架机械性能的同时,也使其具有良好的细胞相容性,不影响细胞的生长增殖和代谢,可以进一步用作组织工程皮肤的支架材料。     

应用转BMP7基因软骨细胞构建组织工程软骨

目的:利用转BMP7基因软骨细胞构建组织工程软骨,测定BMP7基因在构建的组织工程软骨中的表达,探讨与未转BMP7基因软骨细胞构建的组织工程软骨的生物学差异。方法:实验于2004-06/2005-01在哈尔滨医科大学附属第二医院临床药学药物研究所完成。应用转染重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体质粒并用G418筛选14d的阳性克隆软骨细胞,以胶原-纤维蛋白凝胶为支架,构建转BMP7基因组织工程软骨。以未转BMP7基因组织工程软骨作为对照,软骨细胞的接种密度为5×109L-1。用甲苯胺蓝、苏木精-伊红染色对组织工程软骨培养物组织学分析;原位杂交法检测Ⅱ型胶原mRNA的表达;透射电镜观察组织工程软骨培养物的超微结构;原位杂交和免疫组化法测定体外培养物BMP7mRNA和蛋白的表达。结果:①BMP7基因转染软骨细胞情况:G418筛选7d时大量细胞死亡,约30%的细胞存活,且贴壁生长。G418连续筛选14,28d均有阳性克隆细胞生成,贴壁生长率100%,存活的阳性克隆细胞为转染成功的软骨细胞。②组织工程软骨培养物大体形态及显微镜观察结果:构建的组织工程软骨培养物呈浅粉红色胶冻样圆盘状,透明,体积约为16mm×16mm×3mm。显微镜下只能观察到呈圆形的浅层细胞。③组织工程软骨培养物组织学分析结果:组织工程软骨培养物体外培养7,14,28d,细胞周围有丰富的细胞外基质,转BMP7基因组织工程软骨培养物细胞基质较多,体外培养14d软骨细胞合成和分泌最为活跃。④组织工程软骨培养物Ⅱ型胶原表达mRNA原位杂交检测结果:软骨细胞核周围呈棕黄色,有mRNA表达。⑤不同培养时间下组织工程软骨培养物DNA含量的测定情况:DNA含量随着培养时间的推移逐渐增加,21d时达到高峰,转BMP7基因比未转染BMP7基因的组织工程软骨培养物DNA含量高(P<0.05)。⑥不同培养时间下组织工程软骨培养物糖胺多糖含量的测定情况:转BMP7基因组织工程软骨培养物体外培养14d时糖胺多糖含量最高,且各时间点糖胺多糖含量均高于未转BMP7基因组织软骨培养物(P<0.05)。⑦组织工程软骨培养物的超微结构观察:与未转BMP7基因组织工程软骨培养物比较,体外培养7d,转BMP7基因组软骨培养物内软骨细胞细胞器发达,内质网、线粒体和高尔基体相对较丰富,细胞基质合成较旺盛;体外培养21d,转BMP7基因组织工程软骨培养物中软骨细胞粗面内质网仍较发达,线粒体和高尔基体相对减少,细胞基质合成能力减弱。⑧BMP7mRNA表达原位杂交测定结果:体外培养7,14,21d,转BMP7基因组织工程软骨培养物软骨细胞中均有BMP7mRNA表达,而未转BMP7基因组织工程软骨培养物未见软骨细胞表达BMP7mRNA。⑨BMP7蛋白表达免疫组化测定结果:体外培养7,14,21d,转BMP7基因组织工程软骨培养物软骨细胞中均有BMP7蛋白表达,而未转BMP7基因组织工程软骨培养物未见软骨细胞表达BMP7蛋白。结论:成功构建转BMP7基因组织工程软骨,其生物学特性优于未转BMP7基因软骨细胞构建的组织工程软骨,作为移植物修复软骨组织缺损具有一定的可行性和优越性。     

壳多糖组织工程支架材料的制备及其应用

目的:探索一种简单的制备壳多糖细胞外基质网架的方法,考察该基质网架作为组织工程支架材料应用的可行性。方法:壳多糖溶于乙酸,搅拌成均匀泡沫状,冷冻铸型制成海绵状多孔基质网架。利用光镜、电镜等方法测定该网架的孔径和空孔率。分别应用该网架构建复层组织工程皮肤和组织工程软骨。 结果：制备的壳多糖网架外观呈多孔海绵状,光镜下观察有大小不等的孔隙;扫描电镜下观察,网架错综相连成许多网孔,孔径为83～136 μm,平均孔径为110 μm,平均三维空孔率为78%。构建的复层组织工程皮肤具有与天然皮肤极为相似的表皮和真皮双层结构,皮肤角朊细胞和成纤维细胞贴附于网架生长、增殖,形成连续的细胞层,细胞层数增多明显,并分泌角质样物质和基质样物质,网架逐渐降解。软骨细胞在网架上贴附、增殖良好,并分泌细胞外基质;组织学观察有新生软骨组织形成。结论：制备的壳多糖细胞外基质网架具有一定的孔径和空孔率,适于细胞贴附生长和增殖,将其作为组织工程支架材料具有较好的应用前景。     

高原环境对大鼠血压的影响

目的 探讨高原缺氧对大鼠血压的影响.方法 将30只Wistar大鼠从低海拔运输至海拔3658米的高原,随机分为高原缺氧组和吸氧组,用无创尾动脉测量法测量进入高原后1个月内血压.结果 缺氧组进入高原后第1天(136.15±4.58 vs 130.25±5.49,P＜0.05)、第7天(139.44±3.75 vs 132...     

组织工程技术尿道重建的实验研究

目的 利用组织工程技术进行人工管状皮肤的培养，探讨其用于尿道重建的可行性。方法 用Wistar大鼠乳鼠皮肤为细胞来源，结合管状壳多糖基质网架，在体外共同培养成复层皮肤结构，移植到裸鼠皮下。分别于移植的5、7、14、28、35d收取标本，光镜下观察移植物生长情况。以没有种植细胞的壳多糖基质网架作为对照组，进行对比分析。结果 移植物在裸鼠皮下生长良好，未发生收缩。移植初期细胞数量少，排列不规律；随着时间的延长，细胞数量逐渐增多，排列趋于规律。所有移植物均见成纤维细胞生长，约57层，细胞呈长梭形，成纤维细胞向表皮细胞层游走，并规律的生长在表皮细胞层下，细胞大致按层生长，只有少量细胞相互长人对方。在移植后的5d，可见有毛细血管长入。之后，毛细血管的数目日渐增多。移植物的表皮层生长良好，呈4-6层，但分化较差。对照组可见有大量炎性细胞。结论 移植物的成纤维细胞生长、分化较好，表皮细胞增殖较好，但分化差。以壳多糖为支架的人工皮肤进行尿道修复具有可行性。     

大鼠角朊细胞的无滋养层培养

目的 :探索一种新的表皮角朊细胞 (角蛋白细胞 ,KCs)的培养方法。方法 :应用含有新生牛血清并附加多种调节因子的 DMEM- F1 2培养基 ,对大鼠表皮 KCs进行无滋养层法培养。结果 :大部分 KCs在接种后 36h贴壁 ,并有集落形成。培养至第 9天 ,细胞接近铺满单层。结论 :采用无滋养层法培养大鼠 KCs不仅可行 ,而且具有细胞成活率高、避免滋养层细胞影响等优点。为构建组织工程人工皮肤提供了理想的种子细胞     

重组pcDNA3.1-BMP7转染兔膝关节软骨细胞及其表达

目的:将重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体转染至培养的兔膝关节软骨细胞中,观察BMP7基因在兔关节软骨细胞中的表达。方法:实验于2003-08/2004-08在哈尔滨兽医研究所完成。①选取清洁级健康成年家兔1只,兔膝关节软骨切碎后取2.0～2.5kg软骨组织,进行关节软骨细胞的分离与培养。②脂质体与pcDNA3.1-BMP7DNA质粒形成脂质体-DNA质粒复合物,复合物的最佳比例为脂质体10μL、pcDNA3.1-BMP7质粒4μg。用含G418400mg/L的正常培养液筛选转染pcDNA3.1-BMP7DNA质粒的软骨细胞,显微镜观察细胞的形态及活性。③软骨细胞转染后7d和28d,分别用聚合酶链式反应、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Westernblot、免疫荧光、原位杂交检测等方法测定BMP7蛋白在软骨细胞中的表达。结果:①家兔膝关节软骨细胞的分离与培养情况:家兔膝关节软骨切碎后用胰蛋白酶/Ⅱ型胶原酶进行消化,能使细胞与细胞外基质很好地分离。接种24h,部分细胞开始贴壁生长,72h后分裂增殖,7d时细胞融合率为90%～100%。贴壁初期细胞呈圆形或三角形,以三角形为主,每7d传代1次。②脂质体介导下pcDNA3.1-BMP7质粒转染兔软骨细胞情况:转染后的软骨细胞用G418筛选,4d转染效率约15%,阳性克隆细胞七八天融合率约为90%。G418连续筛选28d,阳性克隆细胞仍然存活,细胞融合率为100%。未转染pcDNA3.1-BMP7质粒的细胞,G418筛选4d时细胞全部死亡。③转染后兔软骨细胞聚合酶链式反应检测结果:聚合酶链式反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分离,结果在1.3kb处可见DNA条带,作为对照的软骨细胞未见此DNA条带。④转染后软骨细胞BMP7蛋白表达电泳检测结果:在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上可见相对分子质量约为18000的电泳条带。⑤转染后软骨细胞BMP7蛋白表达的Westernblot检测结果:可见相对分子质量约为18000的特异性条带。⑥转染后软骨细胞蛋白表达的免疫荧光检测结果:转染7,28d的软骨细胞核周围均可见绿色荧光,未转染的软骨细胞未见BMP7蛋白表达。⑦转染后软骨细胞原位杂交检测结果:转染pcDNA3.1-BMP7质粒且G418筛选7,28d的软骨细胞细胞核周围均呈黄褐色,未转染的软骨细胞未见BMP7表达。结论:用脂质体将pcDNA3.1-BMP7DNA质粒转染至兔关节软骨细胞,BMP7在关节软骨细胞中获得表达,为软骨损伤的基因治疗及用作种子细胞构建组织工程软骨奠定实验基础。     

组织工程化人工皮肤胶原蛋白和蛋白多糖的代谢

背量：真皮的细胞外基质由胶原蛋白、弹性蛋白和其他基质成份组成。组织工程化人工皮肤作为一种体外皮肤模型应当具有合成、分泌和分解细胞外基质功能。 目的：观察组织工程化人工皮肤胶原蛋白和蛋白多糖的代谢。 设计：单一样本观察。 单位：北京大学深圳医院皮肤科。 材料：转铁蛋白；胰蛋白酶；^3H-脯氨酸；天狼星红等。 方法：实验于2000-06／2004-12在北京大学深圳医院皮肤科和吉林大学再生医学科学研究所完成。①参照文献进行组织工程化人工皮肤的制备。②^3H-脯氨酸掺入法测定组织工程化人工皮肤合成胶原蛋白能力，于培养第1，2和3周的人工皮肤培养板孔中，分别加入^3H-脯氨酸，培养4h，并与天然皮肤做对照。③苦味酸-天狼星红染色观察组织工程化人工皮肤合成、分泌胶原蛋白的功能；AB-PAS染色测定组织工程化人工皮肤合成、分泌蛋白多糖功能；均于培养第1,2，3，4和6周进行观察。 主要观察指标：①组织工程化人工皮肤合成、分泌蛋白多糖测定结果。②组织工程化人工皮肤合成、分泌胶原蛋白的功能。③^3H-脯氨酸掺入实验结果。 结果：①培养第7，14天的组织工程化人工皮肤^3H-脯氨酸掺入值与天然皮肤相近，培养第21天的组织工程化人工皮肤^3H-脯氨酸掺入值明显高于天然皮肤。②培养的组织工程化人工皮肤，在偏振光显微镜下可见到有成束的红色双折光物质和细的绿色双折光物质。单纯基质网架只见到红色双折光物质。③培养第1，2周的组织工程化人工皮肤Ab-PAS染色阴性，单纯网架Ab-PAS染色呈阴性，培养第3-6周的组织工程化人工皮肤Ab-PAS染色阳性。 结论：构建的组织工程化人工皮肤具有合成、分泌细胞外基质胶原蛋白和蛋白多糖的功能。     

贴壁生长与悬浮生长树突细胞的免疫学功能比较

目的 探索树突细胞(DCs)的可能生长状态,比较分析不同生长状态DCs的免疫学功能.方法 从正常人外周血分离获得单个核细胞,用不同培养介质常规培养2 h,取贴壁细胞,用含细胞因子的培养液进行培养,在培养过程中光镜下对其进行形态鉴别,然后检测两种DCs促淋巴细胞增殖和诱导免疫反应的功能.结果 7 d后,培养瓶中DCs基本处于悬浮状态,而培养板中DCs基本处于贴壁状态;培养瓶中DCs与培养板中DCs形态与理论相符,但培养板中DCs分化形态优于培养瓶中DCs.而在体外促进淋巴细胞增殖及体外诱导免疫反应方面,培养瓶中DCs的能力优于培养板中DCs.结论 在DCs体外培养至发育成熟的过程中,DCs先贴壁后悬浮的生长性质可能对其免疫学功能有着重要意义.