犬原位回肠构建全尿道、膀胱的实验方法特征

目的:探索犬膀胱全切后以回肠构建全尿道、膀胱术的实验方法。方法:实验于2004-12/2005-07在吉林大学药学院生物工程研究室完成。体质量13kg的雄性京犬12只,术前禁食24h,以30g/L戊巴比妥钠按1mL/kg剂量对犬麻醉。取腹部正中切口,切除膀胱及尿道。在距回盲部约10cm处取一段30cm带血供的回肠袢,恢复肠道的连续性。取25cm回肠沿着肠管系膜的对侧缘纵向剖开,将剖开的肠管对折缝合成袋状,并将两侧输尿管种植于回肠新膀胱的适当位置。取5cm回肠剥离黏膜层并缝制成管状,构建尿道,在回肠新膀胱的底部戳孔与其缝合。连接在膀胱及尿道的原位,术中静点氧氟沙星100mL(含氧氟沙星0.2g/L)、葡萄糖注射液250mL、生理盐水250mL、缝合术后刀口,并静点氧氟沙星0.2g/d,连续给药7d,1周后正常进食、继续饲养1个月,观察动物排尿情况,行X射线影像学检查。结果:9只犬进入结果分析,另3只由于麻醉过度死亡。术后1个月观察实验动物犬,进食正常,排尿正常。术后4周X射线造影检查显示:贮尿囊显影良好,无梗阻;回肠替代膀胱充盈,肠黏膜替代尿道再生状况良好。结论:建立的犬膀胱全切原位回肠代膀胱、尿道术的实验方法,可做为组织工程膀胱、尿道移植研究的模型。     

组织工程化人工皮肤胶原蛋白和蛋白多糖的代谢

背景:真皮的细胞外基质由胶原蛋白、弹性蛋白和其他基质成份组成。组织工程化人工皮肤作为一种体外皮肤模型应当具有合成、分泌和分解细胞外基质功能。目的:观察组织工程化人工皮肤胶原蛋白和蛋白多糖的代谢。设计:单一样本观察。单位:北京大学深圳医院皮肤科。材料:转铁蛋白;胰蛋白酶;3H-脯氨酸;天狼星红等。方法:实验于2000-06/2004-12在北京大学深圳医院皮肤科和吉林大学再生医学科学研究所完成。①参照文献进行组织工程化人工皮肤的制备。②3H-脯氨酸掺入法测定组织工程化人工皮肤合成胶原蛋白能力,于培养第1,2和3周的人工皮肤培养板孔中,分别加入3H-脯氨酸,培养4h,并与天然皮肤做对照。③苦味酸-天狼星红染色观察组织工程化人工皮肤合成、分泌胶原蛋白的功能;AB-PAS染色测定组织工程化人工皮肤合成、分泌蛋白多糖功能;均于培养第1,2,3,4和6周进行观察。主要观察指标:①组织工程化人工皮肤合成、分泌蛋白多糖测定结果。②组织工程化人工皮肤合成、分泌胶原蛋白的功能。③3H-脯氨酸掺入实验结果。结果:①培养第7,14天的组织工程化人工皮肤3H-脯氨酸掺入值与天然皮肤相近,培养第21天的组织工程化人工皮肤3H-脯氨酸掺入值明显高于天然皮肤。②培养的组织工程化人工皮肤,在偏振光显微镜下可见到有成束的红色双折光物质和细的绿色双折光物质。单纯基质网架只见到红色双折光物质。③培养第1,2周的组织工程化人工皮肤Ab-PAS染色阴性,单纯网架Ab-PAS染色呈阴性,培养第3～6周的组织工程化人工皮肤Ab-PAS染色阳性。结论:构建的组织工程化人工皮肤具有合成、分泌细胞外基质胶原蛋白和蛋白多糖的功能。     

维生素C对大鼠肾小管上皮细胞增殖活力的影响

目的优化大鼠肾小管上皮细胞的培养方法,为肾脏疾病的体外研究提供一定的技术支持。方法采用Ⅱ型胶原酶消化法结合Percoll密度梯度离心法,分离纯化肾小管节段,对肾小管节段进行贴壁培养,待上皮细胞爬出后,通过流式细胞仪分析细胞角质素-18（CK-18）的表达情况,并用免疫组化方法对CK-18在肾小管上皮细胞中的表达进行定位;通过不同剂量的维生素C作用,CCK-8方法分析大鼠肾小管上皮细胞的增殖活力改变。结果肾小管节段贴壁培养1-2天后,肾小管上皮细胞从节段内爬出,培养3-4天,细胞密集生长;随着传代进行,肾小管上皮细胞凋亡比例增加,增殖活力减弱,在维生素C的作用下,可在一定程度上减缓细胞的老化速度。结论维生素C可适度延长肾小管上皮细胞的体外培养时间,增强细胞活力,方法经济简便。     

组织工程化人工皮肤的胶原蛋白代谢研究

目的检测组织工程化人工皮肤的细胞外基质成分——胶原蛋白的合成和含量的动态变化,为组织工程化人工皮肤的研究提供生物化学依据。方法利用壳多糖作为基质网架制备组织工程化人工皮肤,用3H-脯氨酸掺入法测定胶原蛋白合成,Woessner法测定胶原蛋白含量。结果随着培养时间的延长,组织工程化人工皮肤胶原蛋白含量和合成能力呈上升的趋势。结论利用壳多糖作为基质网架制备的组织工程化人工皮肤具有合成和分泌胶原蛋白的能力。     

表皮生长因子及胶原网架对培养成纤维细胞的影响

目的：观察表皮生长因子（EGF）及胶原网架对体外培养的皮肤成纤维细胞（FB）增殖的影响。方法：酶消化法分离大鼠皮肤FB,以含有10%新生牛血清的DMEM培养液进行培养,采用细胞计数、MTT法、组织学方法测定细胞增殖能力和形态变化。结果：培养液中EGF浓度大于5 μg•L^-1时,FB的增殖活性随EGF浓度的增加而增加,在 20 μg•L^-1浓度时达到最大。植入胶原网架中的FB,随着培养时间的延长,细胞数量增加缓慢。结论：EGF对FB的增殖具有促进作用,而胶原网架对FB的增殖速率具有一定的调节作用。     

rhHSP70-HER2/neu抗原肽对小鼠乳腺癌的治疗作用研究

目的：使用在毕赤酵母中重组表达的rhHSP70与合成的胍R2／neu抗原肽在特定条件下形成复合物，探讨其用于肿瘤生物治疗的可行性。方法：在ADP存在的条件下，将rhHSP70与合成的HER2／neu抗原肽体外非共价结合形成复合物，并分次免疫BALB／c小鼠，检测该复合物诱导特异性CTL的能力和对小鼠乳腺癌的治疗作用。结果：rhHSP70-HER2／neu抗原肽复合物免疫小鼠后，可以诱导出肿瘤特异性CTL，并对小鼠的乳腺癌有明显的治疗作用。结论：在毕赤酵母中重组表达的rhHSP70可以在体外与一定的抗原肽非共价结合形成复合物，该复合物具有较强的诱导特异性CTL的能力。     

应用几丁质胶原网架构建组织工程软骨

目的：探索利用几丁质胶原网架构建组织工程人工软骨的方法。 方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化、传代培养后,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,将几丁质纤维网架浸入上述混合物中制成人工软骨培养物并在体外培养。将培养1周的组织工程培养物,植入同种异体动物皮下组织培养4周,观察组织工程软骨的形成情况。 结果：细胞在几丁质网架培养物中分布均匀,细胞多呈三角形或梭形,培养物体积收缩不明显,经体内培养存活的软骨细胞分泌Ⅱ型胶原,有血管和炎性细胞的侵入。结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白混合凝胶与几丁质纤维网架载体为支架植入软骨细胞以后,在体外和体内都可以培养构建出较大的组织工程软骨。     

角膜缘干细胞缺乏动物病理模型的建立

目的：研究角膜缘干细胞缺乏动物模型建立的方法，为组织工程角膜上皮的损伤移植研究奠定动物病理模型基础。方法： 利用角膜缘上皮全周板层手术将实验动物兔右眼角膜缘后5 mm，环绕角膜缘全周将球结膜剪开，将全板层角膜及角膜缘外5 mm的球结膜组织一同剪去，用刮刀刮去角膜上皮层。术后7、14、28 d做裂隙灯检测、荧光素染色检查、PAS检测、照相，观察角膜上皮的混浊及血管化程度以确定动物模型是否成功。结果：手术1 d后实验兔右眼结膜红肿，眼睑轻度肿胀；3 d后生成红色肉芽组织，并伴随细小血管增生。7 d后荧光素染色阳性，角膜缘全周细小血管向角膜中央逐渐长入。14 d后长入角膜的结膜组织覆盖角膜。28 d后细胞印迹学检查核/浆体积比为1∶4～1∶5 ，PAS染色呈阳性,成功建立角膜缘干细胞完全缺失的病理模型。结论:可通过手术法代替化学法建立角膜缘干细胞缺乏动物病理模型，本研究为角膜病的治疗奠定了实验学基础。     

抗原受体基因重排克隆性检测在淋巴瘤诊断中的应用

本研究旨在探讨抗原受体基因重排克隆性检测在淋巴瘤诊断中的意义。收集分析了31例淋巴瘤组织,石蜡包埋切片,HE染色后观察形态,免疫组织化学分析免疫表型。采用BIOMED-2标准化试剂盒检测抗原受体基因重排克隆性。结果表明,31例病例中形态学及免疫组织化学分析疑似T细胞淋巴瘤12例,T细胞反应性增生1例,B细胞淋巴瘤16例,B细胞反应性增生2例。基因重排克隆性检测免疫球蛋白(Ig)阳性率94.44%(17/18),T细胞抗原受体(TCR)阳性率92.31%(12/13),2例阴性。最终12例确诊为T细胞淋巴瘤,B细胞淋巴瘤17例,反应性增生2例,阳性检出率为93%。结论:抗原受体重排基因克隆性分析是诊断淋巴瘤的一种有效辅助手段。     

巴斯德毕赤酵母表达的人抑瘤素M发酵条件及发酵产物分析

目的：研究巴斯德毕赤酵母表达的人抑瘤素M（hOSM）大规模发酵条件。方法：利用hOSM毕赤酵母高表达菌株,于试管水平进行发酵pH条件的摸索,以补料分批培养方式在 80 L发酵罐中对hOSM工程菌进行3个批次的高密度发酵,控制和优化各种发酵条件,通过SDS-PAGE对发酵产物进行分析。结果：最终确定在pH 5.0的FM21培养基中扩增菌体,待菌体密度达190 g/L 时添加甲醇诱导,在发酵液pH 5.5的条件下,发酵温度稳定在28℃,通入空气的流量为2 vvm, 转速为650 r/min,罐内压力为10 P,溶解氧保持在25%左右,甲醇流加速度在9.3 mL/h/L 初始发酵液体积,诱导36 h时结束发酵,hOSM占分泌总蛋白的28%,产量达到280 mg?L-1。结论：应用hOSM工程菌能够进行稳定的发酵,为进行下一步生物学功能测定提供充足的物质基础。