结核分支杆菌分泌蛋白Mtb81克隆、表达、纯化及血清学诊断价值的初步研究

目的 通过结核分支杆菌Mtb81基因在大肠杆菌中的表达, 获得大量纯化的重组Mtb81蛋白.通过Western -blot和ELISA方法评价Mtb81抗原,检测血清中抗结核抗体的灵敏度和特异性,为进行结核病血清学诊断打下基础.方法 应用PCR技术扩增结核分支杆菌H37Rv Mtb81DNA序列;构建pET24b-Mtb81重组质粒,然后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3);通过Western-blot鉴定重组Mtb81蛋白,采用Chelating Sepharose Fast Flow纯化重组 Mtb81蛋白;将纯化的重组Mtb81蛋白通过Western-blot、酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,检测结核病人及正常人血清中的抗体,应用Microsoft Excel软件统计分析实验数据.结果 pET24b-Mtb81在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30%左右.纯化后的Mtb81样品经SDS-PAGE和光密度扫描分析表明其纯度为95%左右.纯化后的Mtb81蛋白通过Western-blot鉴定,结果显示:加入结核病人血清抗体于目的蛋白位置有一条显色带,而加入正常人血清组则无显色反应;酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,检测30例结核病人及正常人血清中的抗体,结果显示:rMtb81的特异性和灵敏度分别为96%、93%.结论 pET24b -Mtb81大肠杆菌工程菌株能高效表达Mtb81蛋白,Western-blot结果证明表达蛋白具有很好的免疫反应性和抗原特异性;ELISA结果证明重组Mtb81检测结核病人血清中的抗结核抗体,具有较高的灵敏度和特异性.     

小鼠肺、肝、脾组织病理学变化对结核DNA疫苗保护作用的评价

目的:评价结核分支杆菌MPT64、ESAT6 DNA疫苗的保护效力和细胞因子的增强作用.     

几种结核分支杆菌重组蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究

目的　了解结核分支杆菌重组抗原ESAT6 (E)、MPT64 (M)、Ag85A(A)及两两混合物诱发豚鼠产生迟发型超敏 (DTH)反应的能力。方法 常规皮肤实验法 :灭活H₃₇R_v全菌体致敏豚鼠,皮肤试验以生理盐水为阴性对照,5UPPD标准品为阳性对照,0.8μgE、0.8μgM、0.8μgA、0.4μgA+0.4μgM、0.4μgA+0.4μgE、0.4μgE+0.4μgM分别于背部皮内注射,注射后24、48、72h分别测量硬结反应横、纵直径 (mm),取二者的平均值。皮肤试验轮圈法 :生理盐水、5UPPD及0.8μgE、0.8μgM、0.8μgA、0.4μgA+0.4μgM、0.4μgA+0.4μgE、0.4μgE+0.4μgM,以轮圈法注射于同一只豚鼠背部两侧,每批6只,共3批。注射后24、48、72h分别测量硬结反应横、纵直径 (mm),取二者的平均值。结果 常规皮肤试验0.8μgM、A、M+E及E+A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比无显著性差异 (P＞0.05),而0.8μgE抗原及M+A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比有显著性差异(P＜0.05)。时间效应 :重组抗原及其混合物诱发豚鼠DTH的平均直径24h平均直径显著高于48h平均直径 (P＜0.05),24h测量效果较好。轮圈法皮肤试验排除个体差异后,结果与常规皮肤试验结果一致。结论 从试验结果看,重组ESAT6抗原及MTP64与Ag85A混合物诱发豚鼠DTH反应强于PPD。     

多种标志物在人群结核病分子流行病学研究中的应用

背景:目前世界正在开展很多结核病流行病学研究。对IS6110杂交带少于6条的菌株应用一个二级标志物指纹分析增强了菌株的追踪,但它对人群结论的影响尚未很好地研究。 目的:对低拷贝结核分支杆菌菌株应用多态性富含GC重复序列(PGRS)进行二级基因分型。探讨其对以人群为研究背景的流行病学研究结论的影响。 设计:对1991—1996年旧金山结核病例,通过单用IS6110及联合采用PGRS/IS6110定义菌株成簇,以便1)估计近期的传播;2)评价细菌群体参数在理论上对这些估计的影响;3)评价近期传播的危险因素。 结果:对低拷贝菌株(所有菌株的20.3％)进行二级分型,使近期传播的估算值由29.1％下降到25.3％(P=0.03)。补充基因分型造成不同估算值的最主要的影响参数是低拷贝菌株的比例和成簇的数量。对于上述两种分析方法而言。导致近期传播的危险因素是一样的。 结论:结核分支杆菌二级基因分型的统计和推论似乎取决于人群中低拷贝菌株的比例。该比例低时,或没有多少二级特型匹配时,补充基因分型在人群水平研究中的作用可能就很小。     

NAT2基因多态性与抗结核药物性肝损害的关系

目的探讨汉族人群N-乙酰基转移酶2(NAT2)基因多态性与抗结核药物性肝损害(ATDLI)易感性的关系。方法回顾性分析抗结核治疗后发生肝损害的结核病患者228例(肝损害组),未发生肝损害的结核病患者260例(无肝损害组),应用时间飞行质谱技术(MassARRAY)检测NAT2基因多态性。结果在筛选出的10个标签单核苷酸多态性(tagSNP)位点中,NAT2启动子区域rs4646243的T等位基因和rs4646246的A等位基因构成的突变纯合及杂合基因型均与抗结核药物性肝损害保护性有关联,rs1115784、rs1041983和rs1799930的纯合突变基因型与抗结核药物性肝损害风险相关联,其中rs1041983和rs1799930的突变纯合基因型与抗结核药物性肝损害高度关联。在10个标签SNP位点中发现2个单体域,位于单体域1的单体型‘TGAA’和位于单体域2的单体型‘TAG’与抗结核药物性肝损害相关联。在NAT2基因上还发现2个抗结核药物性肝损害保护性的单体型:位于单体域1的单体型‘CGGG’及位于单体域2的‘CGG’。结论汉族人群NAT2基因多态性与抗结核药物性肝损害的发生密切相关,通过检测NAT2基因及单体型,可以在抗结核治疗前筛选出肝损害发生风险较高的患者。     

四种卡介苗重组疫苗对小鼠免疫原性的研究

目的研究esat6-卡介苗重组疫苗、mpt64-卡介苗重组疫苗、ag85a-卡介苗重组疫苗、ag85b-卡介苗重组疫苗的免疫原性。方法通过ELISA法检测小鼠血清中特异性抗体,用MTS法分析其脾淋巴细胞增殖指数。结果以生理盐水、卡介苗为对照,用各卡介苗重组疫苗免疫小鼠后,各组小鼠体重变化与对照组相比差异无统计学意义。应用不同抗原检测各组小鼠不同时间采集的血清,各组有其特异性抗体产生;ag85a-卡介苗重组疫苗能提高卡介苗刺激B细胞产生抗体的水平;各卡介苗重组疫苗免疫后15d,抗体水平已有升高,45d时达到最高水平。用不同抗原刺激各组小鼠脾淋巴细胞,平均刺激指数均达2.0以上,esat6-卡介苗重组疫苗组小鼠脾淋巴细胞的刺激指数稍高,其它各组之间差异无统计学意义。结论结核分枝杆菌esat6、mpt64、ag85a、ag85b基因在卡介苗中都能够表达特异的蛋白,刺激小鼠产生特异性抗体,均能刺激T淋巴细胞产生细胞免疫。     

半定量法检测结核DNA疫苗中SDS残留量的方法学验证

目的 建立半定量法检测十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)残留量并进行方法学验证,用于结核DNA疫苗的质量控制。方法 样本中残留的SDS与吖啶橙形成复合物,用Spectra Max 340PC微孔板检测器测定该复合物的吸光度。通过定量法测定SDS的残留量时,样品的吸光度不在标准曲线线性范围内,采用对比供试品与对照溶液的吸光度的半定量法,判断供试品中SDS的残留量。结果 该方法回收率范围为102%～105%,不同人员、不同时间测定结果一致,该法受辅料、测试温度、萃取时间的影响较小,测定的3批供试品SDS残留量均小于0.02%。结论 建立的方法准确度、中间精密度、专属性和耐用性较好,可用于结核DNA疫苗中SDS残留量的快速检测。     

以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的酶联免疫斑点技术在脊柱结核感染辅助诊断中的应用价值

目的评价以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的酶联免疫斑点(ELISPOT)技术在脊柱结核感染辅助诊断中的应用价值。方法选取2012年5月至2013年12月广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科和南方医科大学南方医院脊柱骨科收治的疑似脊柱结核患者91例,根据临床和细菌性诊断结果分为脊柱结核组(n=52)和对照组(n=39)。采用ELISPOT试验检测脊柱结核组和对照组外周血单个核细胞,观察斑点形成细胞的数量。患者同时接受结核菌素(PPD)皮肤试验、血清抗结核抗体检测、病灶病理学检查、抗酸杆菌涂片和病灶结核分枝杆菌培养,比较不同检测方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值,分析不同检测结果的一致性。结果 52例脊柱结核患者中共47例接受病灶活检穿刺病理检查,其中41例病理证实为结核。ELISPOT试验在脊柱结核诊断中的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为82.7%、87.2%、89.6%和79.1%;PPD皮肤试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为61.5%、46.2%、60.4%和47.4%;血清抗结核抗体试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为55.8%、61.5%、65.9%和51.1%。在脊柱结核患者中,ELISPOT试验的阳性率显著高于PPD皮肤试验(82.7%比61.5%,χ2=5.786,P=0.016)和血清抗结核抗体试验(82.7%比55.8%,χ2=8.847,P=0.003),与病理学检查比较差异无统计学意义(82.7%比87.2%,χ2=0.396,P=0.529)。ELISPOT试验与病理学检查一致性较好(87.2%,κ=0.498,P=0.001)。结论以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的ELISPOT法应用于脊柱结核诊断有良好的敏感性和特异性,可作为脊柱结核感染辅助诊断的有效方法。     

mpt64-卡介苗重组疫苗对结核病预防作用的研究

目的评价mpt64-卡介苗重组疫苗对结核病预防效果。方法观察mpt64-卡介苗重组疫苗对结核分支杆菌感染的预防试验中实验动物半数死亡时间、一定时间内的死亡率、大体病变、T细胞及B细胞免疫功能等指标评价mpt64-卡介苗重组疫苗对结核分支杆菌的预防效果。结果用mpt64-卡介苗重组疫苗对分支杆菌感染进行预防,mpt64-卡介苗重组疫苗组及卡介苗组与生理盐水对照组比较都能延长结核分支杆菌感染小鼠的半数死亡时间,降低2个月的死亡率。结核分支杆菌攻击后2个月,处死小鼠时,mpt64-卡介苗重组疫苗组小鼠脏器与其他各组之间差异无统计学意义。各组小鼠脏器研磨、消化后稀释为不同梯度进行培养,mpt64-卡介苗重组疫苗小鼠肺结核分支杆菌生长的最低稀释度主要集中在10-5,肝、脾结核分支杆菌生长的最低稀释度主要集中在10-4。抗体检测结果及淋巴细胞增殖实验各组间差异无统计学意义。结论初步实验表明:mpt64-卡介苗重组疫苗对结核分支杆菌感染的预防作用与卡介苗差异无统计学意义。     

结核杆菌感染与类风湿关节炎的相关性研究

探讨结核杆菌感染与ＲＡ发病的关系。方法：应用聚合酶链反应和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ技术对１１例活动期ＲＡ患者关节液，３例骨关节炎关节液和６例活动期ＲＡ患者滑膜进行结核杆菌ＤＮＡ测定。ＰＣＲ扩增产物用直接电泳法和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ技术测定。