应用基因芯片直接检测结核病患者各类标本中利福平和异烟肼耐药的价值

目的 研究结核分枝杆菌(MTB)耐药基因芯片直接检测结核病患者临床标本中利福平和异烟肼耐药相关基因的临床价值。方法 回顾性分析125例通过硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)鉴别培养为MTB的临床标本,其中痰标本90例、支气管灌洗液12例、脓液12例、胸腔积液6例、组织标本3例、腹腔积液和尿液标本各1例,应用绝对浓度法同时进行利福平(RFP)和异烟肼(INH)药物敏感性试验(简称“绝对浓度法药敏试验”),并用基因芯片直接检测临床标本中MTB rpoB、katG和inhA基因型。以绝对浓度法药敏试验为标准,评价基因芯片检测RFP、INH耐药和耐多药(MDR)的敏感度和特异度,并且比较两种检测结果的一致性。结果 在125例结核病患者临床标本中,绝对浓度法药敏试验显示对RFP、INH的耐药率和MDR发生率分别为20.0%(25/125)[其中高耐占88.0%(22/25)、低耐占12.0%(3/25)]、17.6%(22/125)[其中高耐占18.2%(4/22)、低耐占81.8%(18/22)]、16.8%(21/125)。初治和复治结核病患者临床标本中MDR-MTB的检出率分别为7.6%(7/92)和39.4%(13/33)。以绝对浓度法药敏试验为标准,应用基因芯片直接检测临床标本中MTB rpoB、katG和inhA基因型,预示对RFP、INH耐药和MDR的敏感度分别为72.0%(18/25)、63.6%(14/22)和61.9%(13/21),特异度分别为91.0%(91/100)、86.4%(89/103)和89.4%(93/104),两种方法的一致率分别为87.2%(109/125)、82.4%(103/125)和84.8%(106/125)。 结论 应用耐药基因芯片直接检测结核病患者临床标本中MTB对 RFP和INH耐药的相关基因突变具有中等的敏感度和较高的特异度,可快速检出对RFP、INH耐药和MDR-TB患者,为临床早期开展有效化疗提供实验依据。     

以脂肪酸合成酶FabH为靶标的化合物体外抗结核作用的初步研究

目的研究结核分枝杆菌脂肪酸合成酶FabH为靶标的化合物的体外抗结核活性，研制新的高效、安全的抗结核药物。方法以平板滤纸法测定化合物对草分枝杆菌的抑菌圈，以试管抑菌法检测化合物对结核分枝杆菌药物敏感株和耐多药分离株的抑制作用。结果18种化合物在500μmol／L浓度时对草分枝杆菌的抑菌圈为1．8～2．4cm，其中7种化合物在250μmol／L和125μmol／L浓度时对草分枝杆菌的抑菌圈为1．5～2．2cm。结核分枝杆菌H37Rv标准株在分别含3mmol／L的18种化合物的培养基上培养2周时，绝大多数含化合物培养基上未见细菌生长；培养4周时，No．115、No．131、No．128、No．129、No．137化合物的抑菌作用较明显。结核分枝杆菌耐多药分离株HB240在分别含3mmol／L的11种化合物的培养基上培养2周和4周时，No．115化合物均显示明显的抑菌作用。结论以脂肪酸合成酶FabH为靶标的大多数化合物在体外都具有不同程度的抗结核活性，尤其是No．115化合物对草分枝杆菌、结核分枝杆菌敏感株和耐药株都具有明显的抑制作用。     

结核分支杆菌DNA片段探针的制备及其应用研究

我国的结核病疫情十分严重，人口占全球20%，病人数(600万)却占世界病人总数(2000万)的30％。而结核病的诊断、治疗需花费很长时间，这是长期以来存在的问题。随着分子杂交技术及PCR的建立与广泛应用，为结核病的诊断开辟了新的途径。     

抗结核药物所致肝损伤的分子机制

直接面视下督导化疗（DOTS）是目前结核病控制的有效策略,它主要应用4个一线抗结核药物异烟肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）和吡嗪酰胺（PZA）联合治疗6个月或更长时间。然而,抗结核药物不良反应尤其是INH、RFP和PZA引发的肝损伤是化疗中最常见的,联合用药时肝毒性的发生率和严重程度明显增加,给结核病的化疗带来了难题。     

结核分支杆菌分泌蛋白Mtb81克隆、表达、纯化及血清学诊断价值的初步研究

目的 通过结核分支杆菌Mtb81基因在大肠杆菌中的表达, 获得大量纯化的重组Mtb81蛋白.通过Western -blot和ELISA方法评价Mtb81抗原,检测血清中抗结核抗体的灵敏度和特异性,为进行结核病血清学诊断打下基础.方法 应用PCR技术扩增结核分支杆菌H37Rv Mtb81DNA序列;构建pET24b-Mtb81重组质粒,然后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3);通过Western-blot鉴定重组Mtb81蛋白,采用Chelating Sepharose Fast Flow纯化重组 Mtb81蛋白;将纯化的重组Mtb81蛋白通过Western-blot、酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,检测结核病人及正常人血清中的抗体,应用Microsoft Excel软件统计分析实验数据.结果 pET24b-Mtb81在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30%左右.纯化后的Mtb81样品经SDS-PAGE和光密度扫描分析表明其纯度为95%左右.纯化后的Mtb81蛋白通过Western-blot鉴定,结果显示:加入结核病人血清抗体于目的蛋白位置有一条显色带,而加入正常人血清组则无显色反应;酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,检测30例结核病人及正常人血清中的抗体,结果显示:rMtb81的特异性和灵敏度分别为96%、93%.结论 pET24b -Mtb81大肠杆菌工程菌株能高效表达Mtb81蛋白,Western-blot结果证明表达蛋白具有很好的免疫反应性和抗原特异性;ELISA结果证明重组Mtb81检测结核病人血清中的抗结核抗体,具有较高的灵敏度和特异性.     

多种标志物在人群结核病分子流行病学研究中的应用

背景:目前世界正在开展很多结核病流行病学研究。对IS6110杂交带少于6条的菌株应用一个二级标志物指纹分析增强了菌株的追踪,但它对人群结论的影响尚未很好地研究。 目的:对低拷贝结核分支杆菌菌株应用多态性富含GC重复序列(PGRS)进行二级基因分型。探讨其对以人群为研究背景的流行病学研究结论的影响。 设计:对1991—1996年旧金山结核病例,通过单用IS6110及联合采用PGRS/IS6110定义菌株成簇,以便1)估计近期的传播;2)评价细菌群体参数在理论上对这些估计的影响;3)评价近期传播的危险因素。 结果:对低拷贝菌株(所有菌株的20.3％)进行二级分型,使近期传播的估算值由29.1％下降到25.3％(P=0.03)。补充基因分型造成不同估算值的最主要的影响参数是低拷贝菌株的比例和成簇的数量。对于上述两种分析方法而言。导致近期传播的危险因素是一样的。 结论:结核分支杆菌二级基因分型的统计和推论似乎取决于人群中低拷贝菌株的比例。该比例低时,或没有多少二级特型匹配时,补充基因分型在人群水平研究中的作用可能就很小。     

四种卡介苗重组疫苗对小鼠免疫原性的研究

目的研究esat6-卡介苗重组疫苗、mpt64-卡介苗重组疫苗、ag85a-卡介苗重组疫苗、ag85b-卡介苗重组疫苗的免疫原性。方法通过ELISA法检测小鼠血清中特异性抗体,用MTS法分析其脾淋巴细胞增殖指数。结果以生理盐水、卡介苗为对照,用各卡介苗重组疫苗免疫小鼠后,各组小鼠体重变化与对照组相比差异无统计学意义。应用不同抗原检测各组小鼠不同时间采集的血清,各组有其特异性抗体产生;ag85a-卡介苗重组疫苗能提高卡介苗刺激B细胞产生抗体的水平;各卡介苗重组疫苗免疫后15d,抗体水平已有升高,45d时达到最高水平。用不同抗原刺激各组小鼠脾淋巴细胞,平均刺激指数均达2.0以上,esat6-卡介苗重组疫苗组小鼠脾淋巴细胞的刺激指数稍高,其它各组之间差异无统计学意义。结论结核分枝杆菌esat6、mpt64、ag85a、ag85b基因在卡介苗中都能够表达特异的蛋白,刺激小鼠产生特异性抗体,均能刺激T淋巴细胞产生细胞免疫。     

PCR直接测序法分析结核分枝杆菌katG基因突变

为了了解我国结核分枝杆菌耐异烟肼（ＩＮＨ）分离株ｋａｔＧ基因突变情况，研究其临床意义。本研究通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）、ＰＣＲ－单链构象多态性（ＳＳＣＰ）和ＰＣＲ直测序法分析９２株结核分枝杆菌临床分离株的ｋａｔＧ基因。以Ｈ３７Ｒｖ标准株为对照，２３株药物敏感体中，２１株ｋａｔＧ基因ＳＳＣＰ分析正常，２株异常。３６株耐非ＩＮＨ药物的分离株中，２０株ｋａｔＧ基因ＳＳＣ正常，１６株异常。３３株耐ＩＮＨ分     

半定量法检测结核DNA疫苗中SDS残留量的方法学验证

目的 建立半定量法检测十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)残留量并进行方法学验证,用于结核DNA疫苗的质量控制。方法 样本中残留的SDS与吖啶橙形成复合物,用Spectra Max 340PC微孔板检测器测定该复合物的吸光度。通过定量法测定SDS的残留量时,样品的吸光度不在标准曲线线性范围内,采用对比供试品与对照溶液的吸光度的半定量法,判断供试品中SDS的残留量。结果 该方法回收率范围为102%～105%,不同人员、不同时间测定结果一致,该法受辅料、测试温度、萃取时间的影响较小,测定的3批供试品SDS残留量均小于0.02%。结论 建立的方法准确度、中间精密度、专属性和耐用性较好,可用于结核DNA疫苗中SDS残留量的快速检测。     

PCR快速检测支气管灌洗液结核杆菌的研究

应用PCR(聚合酶链反应)体外DNA扩增技术检测结核杆菌DNA,灵敏度为1pg,约10～100个菌。所用引物只扩增结核杆菌复合体DNA产生245bp片段,其余受试分支杆菌及链霉菌、大肠杆菌未见该片段扩增,可见具有较高特异性。PCR直接检测83例结核病人支气管灌洗液结核杆菌DNA阳性率56.6％,显著高于涂片(20.5％)和培养(25.3％)。