一种新的重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-mAFP的构建

 目的 构建表达小鼠甲胎蛋白（murine alpha fetoprotein，mAFP）基因的重组腺病毒载体pAd—BM5-GFP-mAFP，并测定其滴度。方法 从Hepal-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR法扩增mAFP基因，测序确认后，插入到pAdBM5-GFP穿梭载体中，双酶切鉴定重组腺病毒载体。线性化重组腺病毒载体与病毒骨架DNA质粒用磷酸钙共沉淀法共转染HEK293A细胞，通过同源重组使腺病毒表达mAFP基因，并在HEK293A细胞中大量扩增含目的基因的重组腺病毒，用TCBn法测定重组腺病毒滴度。结果 成功克隆了小鼠mAFP基因，构建出表达mAFP基因的重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-mAFP，获得了表达mAFP基因的重组腺病毒，病毒滴度达3．2×10^8PFU／ml。结论 本研究成功构建了pAdBM5-GFP-mAFP载体，获得了高滴度表达mAFP基因的重组腺病毒，为进一步开展肝癌的免疫基因治疗奠定了基础。     

CD3AK细胞治疗中晚期肝癌的初步观察

目的：观察中晚期肝细胞癌（ＨＣＣ）患者采用抗ＣＤ３单克隆抗体激活的杀伤细胞（ＣＤ３ＡＫ细胞）治疗的效果。方法：４０例中晚期ＨＣＣ患者分为３组：Ａ组５１例（ＣＤ３ＡＫ细胞加化疗）;Ｂ组４５例（单纯化疗）;Ｃ组４４例（单纯ＣＤ３ＡＫ细胞治疗）。治疗前后分别作肝脏Ｂ超或（和）ＣＴ检查。并检测外周血Ｔ细胞亚群和血清可溶性白细胞介素２受体（ｓＩＬ－２Ｒ）水平。结果：（１）Ａ、Ｂ、Ｃ组的部分缓解率分别为４５．     

肿瘤患者血清sIL-2R水平变化的临床意义

目的：观察肿瘤患者血清可溶性白细胞介素２受体（ｓＩＬ－２Ｒ）水平的变化及临床意义。方法：采用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法对４０例正常人、３０例良性肿瘤及１８０例恶性肿瘤患者的血清ｓＩＬ－２Ｒ水平进行测定。结果：①正常人和良性肿瘤者血清ｓＩＬ－２Ｒ水平较低,恶性肿瘤患者明显升高,与正常人及良性肿瘤患者比较均有极显著性差异（ｐ〈０．００１）;②ｓＩＬ－２Ｒ水平与临床分期及病情严重程度有关,处于Ⅲ、Ⅳ期的肿瘤     

CD_3AK细胞介导细胞因子抗肿瘤作用机制的研究

目的 :探讨 CD3AK细胞介导细胞因子抗肿瘤作用的机制。方法 :将卵巢癌细胞株 (A2 780 )分成两组 ,实验组采用 CD3AK+ A2 780 ,对照组采用 L AK+ A2 780 ,分别共育 2 4h并于作用前和作用后每 4h收集一次上清液以检测 TNF- α和 IFN- γ分泌水平。结果 :实验组和对照组共育前、后上清液中均有 TNF- α和 IFN- γ分泌 ,但共育后 TNF- α和 IFN- γ分泌水平显著高于共育前 (P <0 .0 1) ,且同一效靶比的实验组 TNF- α和 IFN- γ分泌水平明显高于对照组 (P <0 .0 5 )。结论 :CD3AK细胞可通过分泌细胞因子 TNF- α和 IFN- γ杀伤肿瘤细胞。     

人胎肝细胞和胎牛肝细胞低分子抑瘤物对小鼠腹腔积液型S-180细胞抑制作用的比较

目的：对比观察人胎肝细胞和胎牛肝细胞低分子天然抑瘤物（LMW－NTS）对小鼠腹腔积液型S－180细胞生长的抑制效应。方法：分别从胎儿肝细胞和胎牛肝细胞中分离提取出LMW－NTS。采用体外双层软琼脂培养法检测它们对S－180细胞集落生成的抑制作用;给两组荷糖小鼠每日分别腹腔注射人胎肝细胞和胎牛肝细胞LMW－NTS0．5ng/只,每日1次连连结注射21天,观察小鼠的寿命。结果：人胎肝细胞和胎牛肝细胞LMW－NTS对S－180细胞的生长均有明显的抑制作用,且抑制作用随LMW－NTS浓度增高而增强,腹腔注射治疗荷瘤小鼠均能显著延长小鼠帮助。结论：人胎肝细胞和胎牛肝细胞中均存在着一种作用相似的LMW－NTS,在体外均具有明显的抗肿瘤活性。     

鲜壁虎活性组分对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨鲜壁虎活性组分对人肝癌BEL．7404细胞增殖及凋亡的影响。方法将鲜壁虎活性组分冻干粉配制为不同浓度的溶液,并作用于肝癌BEL-7400细胞。以MTT法检测不同浓度的鲜壁虎活性组分对肝癌BEL-7400细胞增殖的抑制作用,流式细胞术分析各组细胞的凋亡情况。结果不同浓度的鲜壁虎活性组分均对肝癌BEL-7404细胞的增殖有抑制作用,且呈剂量．时间依赖效应,实验组的抑制率均较对照组显著提高（P〈0．05）。不同浓度的鲜壁虎活性组分均能诱导肝癌BEL-7404细胞凋亡,高浓度组（2560p,g／m1）的作用更为明显（P〈O．05）。结论鲜壁虎活性组分可显著抑制BEL-7404细胞的增殖,并诱导其凋亡。     

树突状细胞的诱导及抗肿瘤作用探讨

目的：从人外周血诱导树突状细胞（DC）,分析其免疫学特性及抗肿瘤作用。方法：分离人外周血DC前体细胞,采用rhGM-CSF、rhIL-4和肿瘤抗原联合诱导,分析DC表型,采用混合淋巴细胞反应检测DC激发T淋巴细胞增殖能力;乳酸脱氢酶4h释放法检测肿瘤抗原致敏DC与CD3AK混合物的杀瘤活性。结果：DC前体细胞经rhGM—CSF、rhIL-4和肿瘤抗原共同诱导2周,可获得大量成熟DC,其中第7～15天,DC增殖最明显。至第15天,DC纯度达90％以上。DC具有典型的树突状或裙褶样突起,高表达CD86、CD40、HLA—DR、CD83、CDIa分子,能强烈刺激T淋巴细胞增殖。CD3AK细胞与肝癌抗原致敏DC的混合物具有很强的杀伤BEL-7402肝癌细胞的作用,杀伤率显著高于CD3AK细胞（P〈0．01）。结论：可从人外周血诱导培养获得大量功能成熟的DC,能激活T淋巴细胞增殖和显著增强CD3AK细胞的抗肿瘤活性。     

CD3AK细胞的体外诱导及生物学特征的研究

采用抗CD3单克隆抗体(anti-CD3McAb)和基因重组人白细胞介素2(rIL-2)、植物血凝素(PHA)共同诱导人外周血单个核细胞(PBMC)制备CD3AK细胞,应用APAAP法、吉姆萨染色法分析CD3AK细胞的表型、核型等免疫生物学特征.结果表明,微量的niti-CD3AK(终浓度30～50ng/ml)辅以少量的rIL-2(100 U/ml)和PHAS(100μg/ml)共同培养,就能诱导和扩增CD3AK细胞,细胞扩增倍数随着anti-CD3McAb的使用浓度增大而增高,当anti-CD3McAb的使用浓度提高到500ng/ml时,CD3AK细胞扩增倍数可达800倍以上,显著高于LAX细胞的扩增倍数,细胞常呈集落生长.CD3AK细胞的表型分析结果,CD3~ ,CD4~ ,CD8~ 的CD3AK细胞比率分别为(72 ±14)%,(29±4)%,(47±23)%,提示CD3AK细胞是一类以CD3~ ,CD4~ ,CD8~ 细胞为主的异质细胞群,并具     

肝癌患者与正常人外周血树突状细胞的诱导与功能的比较研究

目的对比研究肝癌患者和正常人外周血树突状细胞（Dc）的诱导及其功能异同,探讨能否从肝癌患者外周血诱导出功能正常、具有抗肿瘤作用的DC疫苗。方法取肝癌患者和正常人外周血分离DC前体细胞,应用rhGM—CSF、rhIL-4及肝癌细胞抗原诱导DC。观察DC生长过程的形态学变化,以流式细胞术检测DC表面分子;EUSA法检测DC培养上清中IL-12水平;3H—TdR掺入法检测肝癌细胞抗原致敏DC刺激T细胞增殖的能力;乳酸脱氢酶4小时释放法检测肝癌细胞抗原致敏DC诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的杀瘤活性。结果从肝癌患者和正常人外周血DC前体细胞诱导的DC具有相似的生长过程和细胞形态及功能,其表面分子HLA—DR、CD1a、CD83、CD80、CD86、ICAM-1的表达水平、DC培养上清中IL-12水平、DC刺激T细胞增殖的能力以及所诱生的CTL杀瘤活性等方面比较,差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论可从肝癌患者外周血诱导出功能正常并具有抗肿瘤作用的DC瘤苗,为以DC基础的肝癌的免疫治疗提供实验依据。     

12 C57BL/6J小鼠肝癌动物模型的建立

目的:建立C57BL/6J小鼠肝癌动物模型，为深入开展肝细胞癌的实验研究打下基础。方法:取90只C57BL/6J小鼠，联合采用二甲基亚硝胺（DEN）/四氯化碳（CCl4）/乙醇诱导20周，观察其肝癌的发生情况。另取10只同种小鼠作为正常对照组。RT-PCR法检测病变肝组织中AFP基因表达。结果:实验组90只小鼠共死亡8只；病理学检查发现，存活的82只小鼠中有71只发生肝癌，诱癌成功率为78.9%（71/90），肝癌小鼠的肝癌组织学类型以中、高分化为主；另11只有不同程度的药物中毒性肝炎或肝硬化（12.2%）；对照组小鼠肝脏均未发现明显异常。成癌组中的肝癌组织RT-PCR检测可见AFP基因表达，非肝癌组织及对照组于组织中无AFP表达。结论:采用DEN/CCl4/乙醇联合能诱导出C57BL/6J甲胎蛋白分泌型小鼠肝癌，诱导时间相对较短，癌变率高，部分病变肝组织中伴有肝炎、肝硬化病理学改变，是较理想的研究肝癌的实验动物模型。