SARS冠状病毒E蛋白的表达与纯化

目的研究SARS冠状病毒E蛋白对SARS诊断和预防的价值，利用原核表达系统克隆和表达E蛋白并纯化。方法采用RT—PCR从SARS冠状病毒RNA中扩增出编码N蛋白的基因；经克隆和测序分析后，亚克隆至表达载体DGEX-4T-2，转化大肠杆菌BL21（DE3），PCR和双酶切鉴定；阳性菌株经IPTG诱导，SDS—PAGE分析，进一步以SARS病人血清进行免疫印迹分析；大量诱导表达N蛋白，亲和层析予以纯化。结果RT—PCR扩增出E蛋白基因的特异片段，获得的阳性克隆序列与GenBank中登录的SARS冠状病毒的E蛋白基因序列同源性为100％；E蛋白基因被亚克隆至表达载体pGEX-4T-2，在BL21中获得表达，表达产物能被SARS病人血清识别。表达的E蛋白经亲和层析获得纯化。结论成功构建了SARS冠状病毒E蛋白的重组表达质粒，在大肠杆菌中表达的E蛋白的融合蛋白具免疫活性。     

弓形虫乙肝病毒多重PCR及芯片杂交技术的研究

目的 建立同时检测弓形虫和乙肝DNA的多重PCR和芯片杂交检测方法，为孕产妇TORCH检测的进一步研究提供实验依据。方法以病人血液及弓形虫RH腹水为样本，多重PCR方法为基础，通过基因片段筛选及引物比例调整，进行弓形虫和乙肝病毒基因片段的扩增。然后进一步建立生物芯片检测法以排除PCR假阳性。结果在确定合适的多重PCR引物比例后，扩增结果清晰可辨。在PCR体系中加入Norwalk扩增监控进一步证实了扩增结果的可靠性。芯片与PCR产物杂交的结果具有较好的灵敏性和特异性。结论 建立的针对弓形虫和乙型肝炎病毒检测的多重PCR和芯片杂交方法是有效的，芯片杂交可用于对PCR检测结果的进一步确认。     

弓形虫表面抗原P30DNA疫苗免疫小鼠诱导细胞免疫应答的研究

目的 观察弓形虫表面抗原P30DNA疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫应答。方法 大量制备重组真核表达质粒pBK-P30,用生理盐水（NS）稀释至1μg/μl,1次肌注免疫BALB／c小鼠,分别在免疫后5和10周,通过ConA刺激,MTT法测定免疫鼠脾脏T淋巴细胞转化率;使用间接免疫荧光法,用流式细胞仪对CD4^ 、CD8^ T细胞亚群进行测定。结果 ConA刺激小鼠脾T淋巴细胞发生增殖反应,pBK-P30免疫组与对两对照组及对照组之间的差异均无显著性（P＞0．05）。T细胞亚群CD4^ 、CD8^ 动态分析,CD4^ T细胞在各组增殖均不明显（P＞0．05）,但免疫组CD8^ 细胞数量升高,CD4^ /CD8^ 比率下降,与空质粒pBK-CMV对照组和NS对照组之间差异均有显著性（P＜0．05,P＜0．01）,pBK-CMV对照组与NS对照组之间差异也有显著性（P＜0．01）。免疫后10周,与NS对照组相比较,免疫组和pBK-CMV对照组CD8^ 细胞仍升高（P＜0．01）,但它们之间的差异无显著性（P＞0．05）。结论 弓形虫表面抗原P30DNA疫苗能诱导BALB／c小鼠产生一定的细胞免疫应答。     

弓形虫GRA4基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白4（GRA4）基因，构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-GRA4，重组耻垢分枝杆菌，鉴定重组蛋白的抗原性。方法用聚合酶链式反应（PCR）方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因，克隆入pGEM-T载体，然后亚克隆法构建ps3000-GRA4大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒，经电转化方法，将GRA4基因片断的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis mc^2155）中，用重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠，Western blot方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体。结果成功扩增了弓形虫的GRA4基因并构建克隆质粒pGEMT-GRA4、穿梭质粒ps3000-GRA4，Western blot分析显示，GRA4重组蛋白能被重组质粒免疫小鼠血清识别，分子质量单位约为40．0ku。结论重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白GRA4，具有抗原性，刺激小鼠机体产生了抗弓形虫的抗体，为弓形虫重组BCG（Bacillus Calmette-Guerin）疫苗的研究奠定了基础。     

弓形虫表面抗原P30基因分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达重组质粒的构建及序列测定

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因的分枝杆菌 -大肠杆菌穿梭表达重组质粒并进行其序列测定。方法　弓形虫RH株腹腔接种小鼠 ,收集腹水 ,酚 /氯仿法抽提基因组DNA ;根据基因库P30基因序列设计合成一对引物 ,采用PCR法扩增编码P30的基因片段 ,经低熔点琼脂糖法回收并纯化 ;将P30基因定向克隆到分枝杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒 ,转化大肠杆菌DH5dα,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR鉴定 ;最后对重组子进行序列测定。结果　PCR所扩增的P30基因片段为 10 37bp ,阳性重组质粒pBCG -P30经XbaI+KpnI双酶切 ,获得包含P30和热休克蛋白 (hsp70 )启动子的复合基因片段 ,此片段的大小为 1170bp ,与预期的理论值相符合。序列测定分析进一步表明所克隆的基因为编码P30抗原的基因片段。结论　成功构建编码弓形虫表面抗原P30基因大肠杆菌 -分枝杆菌穿梭质粒pBCG -P30。     

肉类烧烤等烹调师DNA氧化损伤监测研究

目的　研究不同种类烹调操作厨师外周血淋巴细胞DNA氧化损伤的作用。　方法　采用高效液相色谱系统结合电化学测定分析法对不同种类烹调操作厨师外周血淋巴细胞DNA中 8-OHdG的含量进行分析。　结果　①外周血淋巴细胞DNA中的 8-OHdG水平显示 ,肉类烧烤师和煎炸烹调师分别为 ( 2 3 7± 10 3 )和 ( 19 2± 8 5 ) ,明显高于其他粤菜师的 ( 12 6± 5 2 ) (P <0 0 5 ) ;而其他粤菜师与一般服务员的 ( 11 5± 3 6)无显著差异 (P >0 0 5 ) ;②肉类烧烤师外周血淋巴细胞DNA中的 8-OHdG水平与其工龄有关 :③同岗位厨师DNA氧化损伤的效应个体差异较大。　结论　肉类烧烤师和煎炸烹调师的DNA氧化损伤水平高于一般人群 ,肉类烧烤师的DNA氧化与其工龄有关     

不同检材微量血间日疟原虫PCR检测模板制备方法的研究

目的 探寻不同检材微量血间日疟原虫PRC检测模板制备的方法.方法 全血标本采用酚/氯仿抽提法、洗涤沉淀法、Chelex煮沸法和洗涤水煮法;滤纸干血滴及厚血膜标本以Chelex煮沸法和洗涤沉淀法制备模板.以间日疟原虫特异性引物作PCR扩增检测模板制备的效果.结果 采用上述4种不同的方法制备的全血间日疟原虫DNA模板与采用Chelex法和洗涤沉淀法制备的滤纸干血滴以及厚血膜疟原虫DNA模板均可被扩增出1条341bp的间日疟原虫特异性DNA条带,与预期的扩增片断大小一致;不同方法制备的10份间日疟患者血样DNA模板用于PCR扩增检测,结果无明显差异.其中,Chelex煮沸法和洗涤沉淀法对不同检材的疟原虫感染血样DNA模板均能有效制备,且可在同一离心管中进行,减少了交叉污染的机会.结论 Chelex法和洗涤沉淀法简便、实用,适用于不同检材微量血疟原虫PRC模板的制备.     

恶性疟原虫海南株子孢子期SSU rRNA编码基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株子孢子期小亚基核糖体核糖核酸(SSU rRNA)编码基因片段,分析其序列特征.方法 根据恶性疟原虫基因库相关核酸序列设计1对引物,采用PCR方法从海南恶性疟患者血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSU rRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy质粒连接,构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆经双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定序列,采用BLAST软件分析其特征.结果 恶性疟原虫子孢子期SSU rRNA基因扩增片段大小约为347bp;阳性克隆重组质粒双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段;核酸序列测定显示插入的SSU rRNA基因扩增片段含有347个核苷酸,与GenBank中的恶性疟原虫3D7株相同序列进行比对,其同源性为100%,而与7G8株的同源性则为98.0%,其中第153位碱基发生了缺失,第184位碱基由C取代了T,而第188位T碱基与第189位A碱基为插入碱基,第243位碱基则由T取代了C.结论 成功克隆恶性疟原虫海南株孢子期SSU rRNA编码基因序列,该序列相对保守,不同地理株间存在单核苷酸多态性.     

分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6重组卡介苗构建研究

目的构建分泌表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗。方法采用基因拼接（Gene SOEing）法，体外扩增结核杆菌CFP10-ESAT6融合基因，插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000，构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6，用电穿孔法将pBCG3000-CFPIO-ESAT6质粒转化BCG细胞，得到重组卡介苗，热诱导表达CFPIO—ESAT6融合蛋白，SDS—PAGE电泳观察CFP10-ESAT6融合蛋白的表达，Western blot鉴定其生物活性。结果经PCR、酶切及测序鉴定，证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6，经热诱导表达出约22kDa的CFP10-ESAT6蛋白，可分别被鼠抗ESAT6血清、鼠抗CFP10血清识别。结论分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗构建成功。     

深圳地区葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因分析

目的探讨深圳地区葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(G6PD)患G6PD基因单核苷酸多态性位点。从分子水平上提高诊断率。方法设计11对引物，应用ARMS和多聚酶链反应一单链构像多态(PCR-SSCP)银染技术和DNA序列分析了51例G6PD基因。结果其发病率为4．02％；发现13例G1376T突变，所检病例中未发现A95G突变。分别随机抽取1例和2例由ARMS法检出的G1388A突变及G1376T突变病例，对其突变所在的外显子进行测序，结果与ARMS检测的结果完全一致。