弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因。方法 根据GRA4基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,插入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌JM109,经PCR、双酶切、测序验证后,将GRA4基因片段定向亚克隆到载体pGEX-4T-2中构建原核表达重组质粒pGEX-4T-2.GRA4,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Westem blot分析。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组GRA4蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pGEX-4T-2-GRA4重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。     

恶性疟原虫MSA2编码基因分枝杆菌穿梭质粒的构建及序列测定

目的 构建恶性疟原虫FCC－1／HN株MSA2编码基因分枝杆菌穿梭质粒重粒子pBCG5.6/MSA2,并进行序列测定。方法 根据恶性疟原虫MSA2编码基因的两侧序列设计引物，采用PCR技术扩增出MSA2编码全长片段，经低熔点脂脂糖挖块法回收纯化后，插入分枝杆菌穿梭质粒pBCG5.6/MSA2，并转化大肠杆菌DH5α，快速酚法初筛阳性重组子，阳性克隆以PCR法与限制性酶切分析鉴定后，双脱氧链终止法双向进行序列测定。结果 从恶性疟原虫基因组中扩增出约820bp的基因片段，所构建pBCG5.6/MSA2重组体阳性克隆经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致，测序结果确证了插入片段的正确性。结论 成功构建了恶性疟原虫MSA2编码基因分枝杆菌穿梭表达质粒，为恶性疟BCG疫苗的研制奠定了基础。     

间日疟原虫MSP1 C端编码基因的克隆及序列分析

目的 克隆间日疟原虫MSP1C端编码基因,并进行序列测定和分析。方法 根据间日疟原虫MSP1C端编码基因设计1对引物,采用PCR技术从深圳间日疟患者血样(编号为PvSZ1)的核酸提取物中扩增出MSP1C端编码基因,回收纯化后,与T载体连接构建重组子pMD/MSP1,并转化大肠杆菌JM109。阳性克隆以限制性酶切分析与PCR法鉴定后,双脱氧链末端终止法双向测定序列并分析。结果 从间日疟血样提取的DNA中扩增出1119bp的基因片段,所构建的pMD/MSP1阳性克隆重组子经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致。所测定的间日疟原虫PvSZ1C端基因序列与国外Sal-1株比较,碱基数相同,未发现碱基缺失,相同的核苷酸占96.7％,序列中第542位碱基变化为同义突变(GTC→GTT,均编码缬氨酸),第375～542区间的碱基变化数占整个序列变化碱基总数的92.9％(34/37)。所推测的氨基酸序列与Sal-1株比较,同源性为92.5％。结论 成功克隆了间日疟原虫PvSZ1株MSP1C端编码基因,该基因在不同间日疟原虫地理株间相对保守,所克隆基因序列的第375～542核苷酸区域为高频变化区。     

钙蛋白酶10基因多态性对高血压家族史的影响

目的：研究高血压家系和非高血压家系后代中CAPN-10基因多态性与高血压家族史、血糖水平的关系。方法：测定深圳地区17个高血压家系和22个非高血压家系第一、二代直系家属的血糖水平，用PCR单链构型多态法(SSCP)，DNA测序分析CAPN10基因多态性，分析高血压家系与非高血压家系中CAPN-10基因多态性与血糖关系的差异。结果：高血压第一、二代家系中，凡血糖水平高其CAPN-10基因均发生变异，而非高血压家系及高血压家系血糖水平正常检测结果则未见这-差异。结论：CAPN-10基因可能是深圳地区原发性高血压和糖尿病的遗传因素之一。该基因的变异检测对于预测高血压后代是否发生2型糖尿病有一定作用。     

不同地理株间日疟原虫SSUrRNA基因序列比较

目的测定我国间日疟原虫不同地理株红内期SSUrRNA基因序列,比较分析其分子特征。方法收集深圳、海南、湖北和河南四地间日疟患者血样5份（其中海南2份）,并提取核酸DNA,采用PCR从核酸提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,纯化后分别与pGEM—Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定序列,采用BLAsT和MEGA4软件分析序列相互关系特征。结果5株间日疟原虫SSUrRNA基因扩增片段大小一致,约为998bp;核酸序列测定结果显示,所克隆的SSUrRNA基因片段均含有998个核苷酸,不同地理株间SSUrRNA基因序列有9个位点存在变异的可能,两两比对的同源性均高于99．5％,其中河南与湖北株序列的同源性为100．0％;与GenBank中报道的国外6株间日疟原虫相同序列作分子系统进化分析。国内5株间日疟原虫SSUrRNA基因序列与Sa11株遗传距离小,亲缘关系接近。结论测定的国内间日疟原虫SSUrRNA基因序列在不同地理株间相对保守．其间存在的单核苷酸多态性与地理变化有一定程度的关系。     

CpG协同calpain DNA疫苗诱导BALB/c鼠TH1免疫应答和抗日本血吸虫感染

目的 探讨含非甲基化CpG单核苷酸(cpG-ODN)协同calpain DNA疫苗抗日本血吸虫感染的保护性作用、诱导的免疫应答类型及其免疫机理。方法 calpain基因从原核表达载体pGEX-2TK亚克隆到含小鼠IL-2基因启动序列的真核表达载体pVAC，构建含日本血吸虫疫苗候选分子calpain基因的真核表达体系pVAC-calpain的DNA疫苗，构建的DNA疫苗与CpGODN免疫BALB/c小鼠，在不同阶段采血测定免疫鼠抗体的动态变化、RT-PCR分析免疫鼠细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-12的表达，加强免疫1周后用日本血吸虫尾蚴攻击感染免疫鼠，用减虫率、减卵率及其病理组织学指标考核保护性免疫的效果。结果 pVAC-calpain的DNA疫苗体系诱导了IgG抗体的产生，免疫3周后细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-12的表达表现出差异。特别是在CpG-ODN和pVAG-calpain免疫组IFN-γ、IL-12有高度表达，而IL-4的表达受到相对抑制，对攻击感染的日本血吸虫表现出了45％的减虫效果，虫卵肉芽肿的面积显著性的减少。结论 Cp GODN协同日本血吸虫calpain DNA疫苗诱导了THl为主的免疫应答，并能部分抵抗日本血吸虫感染和减轻感染鼠由于TH2免疫应答所导致的虫卵肉芽肿反应，提示CpG ODN能够协同calpain DNA疫苗抗日本血吸虫感染和缓解日本血吸虫免疫病理反应。     

弓形虫DNA疫苗联合诱导BALB/c小鼠保护性免疫力的研究

研究弓形虫表面抗原P30和P22 DNA疫苗联合诱导BALB/c小鼠的保护性免疫作用。48只BALB/c小鼠随机分成4组:A组(NS对照组),肌注生理盐水100μl/鼠;B组(空质粒对照组),肌注pBK-CMV 100μl/鼠(1mg/ml);C组(pBK-P30免疫组)肌注pBK-P30 100μl/鼠(1mg/ml);D组(pBK-P30&pBK-P22联合免疫组)分别肌注pBK-P30和pBK-P22各100μl/鼠(1mg/ml),免疫后5周,通过ConA刺激,MTT法测定免疫鼠脾脏T淋巴细胞转化率,使用间接免疫荧光法,用流式细胞仪对CD4+、CD8+T细胞群进行测定。免疫后10周,免疫鼠腹腔注射弓形虫速殖子攻击感染。结果表明,ConA刺激小鼠脾T淋巴细胞均发生增殖反应,疫苗免疫组略高于两对照组,但4组之间的差异均无显著性(P>0.05)。T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+动态分析,CD4+T细胞在各组的增殖均不明显(P>0.05),但两免疫组CD8+T细胞数量升高,CD4+/CD8+比值降低,与空质粒pBK-CMV对照组和NS对照组之间差异均有显著性(P<0.05,P<0.01),pBK-CMV对照组与NS对照组之间差异也有显著性(P<0.01),两免疫组之间差异无显著性(P>0.05)。弓形虫速殖子攻击感染,联合免疫组平均存活时间较两对照组均延长(P<0.05)。但两免疫组间、pBK-P30免疫组与两对照组之间差异无显著性(P>0.05)。弓形虫DNA疫苗能诱导BALB/c鼠产生特异性细胞免疫应答及部分抗虫免疫保护作用,此两种DNA疫苗联合免疫有一定的免疫保护效果。