人类乳头瘤病毒16型ETC亚基因在耻垢分枝杆菌中的表达

目的在耻垢分枝杆菌Mycobaterium smegmatis mc^2 155中表达人类乳头瘤病毒16型E7C亚基因,为其重组BCG疫苗的研究奠定基础。方法采用电穿孔转化法将重组质粒pBCG-E7C导入耻垢分枝杆菌（M.smegmatis mc^2 155）中,通过卡那霉素抗性筛选经PCR鉴定的重组M.smegmatis mc^2 155,培养于middlebrook7H9 broth（M7H9）培养基中,并添加10%M7H9 enrichment ADC和0.05%Tween 80,37℃培养48 h～72 h,42℃诱导表达5 h,表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及Western blot分析。结果成功构建pBCG3000-E7C质粒,SDS-PAGE显示表达产物的分子质量单位约为6.5 ku,与预期理论值相符,Western blot分析表达产物能被宫颈癌患者血清识别。结论人类乳头瘤病毒16型E7C基因在M.smegmatis mc^2 155中成功表达。     

恶性疟原虫裂殖子表面抗原2基因片段的克隆及表达

目的构建恶性疟原虫海南分离株(FCC-1/HN)裂殖子表面抗原2(MSA2)基因片段的重组真核表达质粒pBK/MSA2.方法采用限制性内切酶法从重组的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pBCG/MSA2中分离出经过测序鉴定的MSA2基因片段,将其亚克隆入真核表达载体pBK-CMV,构建重组真核表达质粒pBK/MSA2.经IPTG诱导,重组质粒在大肠杆菌DH5a中进行表达,并进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹(Western-blot)分析.结果从pBCG/MSA2中分离出MSA2基因片段,成功构建pBK/MSA2重组质粒;SDS-PAGE及Western-blot分析结果显示,特异性蛋白条带的分子质量约为31 ku.结论恶性疟原虫MSA2可在大肠杆菌中成功表达.     

恶性疟BCG多价疫苗及DNA疫苗的实验研制

本项目在恶性疟疫苗候选分子裂殖子表面蛋白-2（MSA2）及环子孢子蛋白（CSP）的分子生物学特征和免疫原性研究的基础上,构建了CSP、MSA2之DNA疫苗,同时率先在国内外构建CSP、MSA2之重组BCG活疫苗,并对疫苗的免疫保护机制、免疫应答及疫苗     

人外周血IL-12 P35 cDNA的巢式PCR扩增、克隆与测序

目的 克隆中国汉族人IL—12P35 cDNA序列，并进行序列测定。方法 利用反转录巢式PCR从健康人外周血总RNA中扩增IL—12P35 cDNA序列，插入T载体PMD—T中，重组质粒转化大肠杆菌JM109，所获克隆经PCR初筛后进行酶切鉴定，阳性克隆进行DNA测序。结果 从健康人外周血总DNA中扩增出约670bp条带，与预期大小相同，PCR与酶切鉴定证明得到PMD／P35阳性克隆，DNA测序证实了插入片段的正确性。结论 在体外成功的扩增、克隆了中国汉族人IL—12P35 cDNA序列。为继续开展IL—12的基础与应用研究奠定了基础。     

间日疟原虫孢子期SSUrRNA基因扩增、鉴定及其诊断应用

目的体外扩增、克隆间日疟原虫孢子期SSUrRNA编码基因特异性片段，分析其分子特征，评价其核酸诊断应用效果。方法根据间日疟原虫基因库相关核酸序列设计引物，采用聚合酶链反应技术从间日疟患者血样DNA提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段，与pGEM—Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109；阳性克隆以双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定分析其序列特征；以SSUrDNA为靶基因，建立间日疟PCR诊断方法，并以镜检法为标准评价其用于间日疟原虫感染的检测效果。蛄果从间日疟患者血样中扩增的SSUrDNA片段大小约为267bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段，含有267个核苷酸，与间日疟原虫Sall株孢子期SSUrRNA基因序列比较，同源性为99．3％，其中第220住为插入了1个碱基“T”，243住碱基由“G”取代了“T”。将纯化的含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以正常人血液核酸提取液倍比稀释成浓度梯度作模板，PER扩增结果显示检测灵敏度至少迭102copy／μl；特异性检验显示仅间日疟原虫患者血样扩增出约267bp的特异性基因片段，而恶性疟原虫、弓形虫、血吸虫、肝吸虫感染患者血样及正常人血未见特异性扩增条带。以镜检法为参照标准，PCR敏感性为100％（102／102），特异性为100％（76／76）。结论所扩增克隆的间日疟原虫孢子期SSUrDNA片段序列具有种特异性且相对稳定，不同地理株间存在单核苷酸多态性，以其为靶基因建立的PCR检测方法敏感、特异，具有良好的推广使用价值。     

日本血吸虫Calpain的DNA疫苗诱导小鼠免疫保护性研究

目的　研究日本血吸虫中国大陆株Calpain的DNA疫苗对Balb/c小鼠的免疫保护性作用。方法　大量制备pVAC质粒DNA和pVAC -CalpainDNA疫苗 ,Balb/c小鼠 5 0只 ,随机均分为对照组和实验组 ,对照组每只小鼠的股四头肌注射接种 10 μgpVAC质粒DNA ,实验组以同样方式注射 10 μgpVAC -CalpainDNA疫苗 ,第 3周加强免疫一次。第 4周每只小鼠经腹部皮肤感染 ( 2 5± 1)条尾蚴 ,感染 6周后剖杀 ,从门静脉灌流收集计成虫数、碎脾计T淋巴细胞总数、从各鼠肝脏的同一部位切下小块肝组织 ,置 5 %KOH溶液消化后 ,计算每克肝组织虫卵数 ,比较减虫率、减雌率和减卵率。于免疫前、第一次免疫后 2周和感染后 2周分别从尾静脉采血 ,用ELISA测定抗体水平。结果　与对照组相比 ,实验组获得 36.84%的减虫率、36.36%的减雌率和 43.31%的减卵率 ,感染后实验组小鼠IgG抗体水平升高幅度大于对照组 ,对照组T淋巴细胞数显著多于实验组。结论　CalpainDNA疫苗可诱导小鼠产生较好的免疫保护作用 ,具有较大的发展潜力     

金葡菌野生株肠毒素B基因克隆及分子特征

目的克隆金黄色葡萄球菌野生株S407030肠毒素B（SEB）基因，并分析其分子特征。方法根据Genebank中金黄色葡萄球菌S6株肠毒素B基因设计1对引物，采用PCR法从金黄色葡萄球菌野生株S407030基因组中扩增目的基因，将目的片段与pMD-18T载体连接构建重组子pMD-18T-SEB，并转化E．coli DH5 α；阳性克隆以双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法作序列测定分析，并以ExPasy Proteoic Tools蛋白分析软件预测其编码SEB蛋白的二级结构。结果从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出约705bp的基因片段，所构建的阳性克隆重组子PCR及双酶切鉴定与预期结果一致；测序结果表明，克隆的SEB基因含705个碱基，与S6株序列相比无碱基的插入或缺失，同源性为98．4％；存在11个碱基变异，其中7个为无义突变，4个为有义突变（突变位点位于第364，699．899．988位，编码氨基酸变化分别为：Ser→Ala、Gln→His、Asn→Ser、Met→Leu）；所预测的2菌株SEB蛋白的二级结掏基本相同。结论本实验成功克隆了金葡菌野生株S407030SEB基因，其在不同菌株间相对保守；由SEB基因点突变引起的个别氨基酸的改变对SEB生物活性与毒力的影响有待进一步研究。     

弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗免疫小鼠诱导细胞免疫应答的研究

目的观察弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫应答.方法大量制备重组真核表达质粒pBK-P30,用生理盐水(NS)稀释至1 μg/μl,1次肌注免疫BALB/c小鼠,分别在免疫后5和10周,通过ConA刺激,MTT法测定免疫鼠脾脏T淋巴细胞转化率;使用间接免疫荧光法,用流式细胞仪对CD4+、CDs+T细胞亚群进行测定.结果ConA刺激小鼠脾T淋巴细胞发生增殖反应,pBK-P30免疫组与两对照组及对照组之间的差异均无显著性(P＞0.05).T细胞亚群CD4+、CD8+动态分析,CD4+T细胞在各组增殖均不明显(P＞0.05),但免疫组CDs+细胞数量升高,CD4+/CDs+比率下降,与空质粒pBK-CMV对照组和NS对照组之间差异均有显著性(P＜0.05,P＜0.01),pBK-CMV对照组与NS对照组之间差异也有显著性(P＜0.01).免疫后10周,与NS对照组相比较,免疫组和pBK-CMV对照组CDs+细胞仍升高(P＜0.01),但它们之间的差异无显著性(P＞0.05).结论弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗能诱导BALB/c小鼠产生一定的细胞免疫应答.     

弓形虫p35蛋白的基因克隆及其分子特征

目的 探讨p35蛋白作为一个鉴别急性感染的诊断抗原和疫苗候选的应用价值。方法 从弓形虫RH株分离总的RNA,应用弓形虫EST基因库合成扩增p35基因片段引物,结合5'和3'末端cDNA快速扩增法进行p35基因5'和3'末端cDNA的扩增,TA克隆RT－PCR产物及DNA顺序分析;用蛋白质分析软件解析p35基因编码的氨基酸的亲水性和可能存在的T、B细胞的表位。结果 p35基因含有1537个碱基,编码378个氨基酸,其氨基酸的亲水性区域分布在氨基酸的201到225和301到340号,且含有多个T、B细胞的表位。结论 p35蛋白的C端区有高的亲水性,并含有T、B细胞的表位,显示了p35蛋白应用于诊断和疫苗开发的可行性。     

恶性疟原虫裂殖子表面抗原2基因片段的克隆及表达

目的 构建恶性疟原虫海南分离株（FCC－1／HN）裂殖子表面抗原2（MSA2）基因片段的重组真核表达质粒pBK/MSA2。方法 采用限制性内切酶法从重组的大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒pBCG/MSA2中分离出经过测序鉴定的MSA2基因片段,将其亚克隆入真核表达载体pBK-CMV,构建重组真核表达质粒pBK/MSA2。经IPTG诱导,重组质粒在大肠杆菌DH5α中进行表达,并进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）及免疫印迹（Western-blot)分析。结果 从pBCG/MSA2中分离出MSA2基因片段,成功构建pBK/MSA2重组质粒;SDS－PAGE及Wetern-blot分析结果显示,特异性蛋白条珲的分子质量约为31ku。结论 恶性疟原虫MSA2可在大肠杆菌中成功表达。