日本血吸虫感染者尿液中特异性IgG及亚类的检测

目的 研究日本血吸虫感染者尿液特异性循环抗体在日本血吸虫诊断上的应用。方法 采集类检确诊的日本血吸虫患者尿液，ELISA法测定尿液中抗日本血吸虫特异性IgG及亚类（IgG1，IgG2，IgG3）抗体；同时肝吸虫阳性患者尿液作为考核交叉反应样本，无寄生虫感染液作为阴性对照。结果 粪检阳性日本血吸虫患者尿液中抗日本血吸虫IgG抗体的检出率为81.0%（17/21），其中IgG1为81.0%（17/21），IgG2为19.0%（4/21），IgG3为23.8%（5/21），肝吸虫患者尿液中IgG1抗体与日本血吸虫抗原有25.0%（2/8）的交叉反应，IgG2和IgG3均未发生交叉反应。结论 日本血吸虫患者尿液中存在抗日本血吸虫的特异性循环抗体，肝吸虫患者尿液中的IgG1抗体与日本血吸虫抗原有一定的交叉反应；但IgG2和IgG3无交叉反应现象，提示尿液中的IgG抗体可以作为血吸虫感染的诊断，尿液中的IgG2和IgG3抗体可以作为日本血吸虫病的鉴别诊断。     

基于SSUrRNA基因序列的间日疟原虫LAMP检测技术的建立

目的克隆分析间日疟原虫小亚基亚单位核糖体核糖核酸(SSUrRNA)特异性基因序列,建立间日疟原虫环介导等温扩增(LAMP)检测技术。方法针对间日疟原虫SSUrRNA种特异性基因序列设计1对引物,采用聚合酶链反应(PCR)从血样核酸提取物中扩增SSUrRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy载体连接,构建重组质粒并转化大肠埃希菌JM109,PCR与双酶切鉴定筛选阳性克隆并测序,设计6条寡核苷酸片段,LAMP检测感染血样中间日疟原虫DNA,扩增产物作琼脂糖电泳分析或直接荧光染色肉眼观察。结果间日疟原虫SSUrRNA基因扩增片段大小约为235 bp;阳性克隆重组质粒插入的SSUrRNA基因扩增片段含有235个核苷酸,与GenBank中的Sal-1株、Belem株间日疟原虫相同序列进行比对,同源性为100%,与PV2008/TR/DEL株、PVK1294株、E1 Salvador株的同源性均为99%,与三日疟原虫、卵形疟原虫及恶性疟原虫的序列同源性均低于95%。将含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以蒸馏水倍比稀释后做LAMP,试验的灵敏度为10 copy/μl;特异性检验显示间疟原虫患者血样DNA呈阳性反应,恶性...     

结核分枝杆菌ESAT-6基因在毕赤酵母中的构建及其表达

目的在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT-6基因。方法以重组质粒pET23a-ESAT-6为模板,亚克隆目的片段ESAT-6至酵母菌分泌表达载体pPICZaA,重组质粒经线性化后电转化转染至毕赤酵母菌GS115菌株,经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达,取细胞裂解上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法分析。结果成功构建了pPICZaA-ESAT-6毕赤酵母表达重组质粒。经甲醇诱导,在酵母细胞内表达分子质量单位为18kDa的蛋白。蛋白质印迹（Western blot）显示,18kDa蛋白被活动性肺结核病人血清抗体识别。结论在毕赤酵母菌中成功表达了带有信号肽ESAT-6基因,为进一步研究新型单位疫苗打下坚实的基础。     

间日疟原虫海南株SSUrRNA编码基因的克隆及其序列分析

目的克隆间日疟原虫海南株红内期小亚基核糖体核糖核酸（SSUrRNA）编码基因片段,并进行序列特征分析。方法采用聚合酶链反应技术从海南间日疟患者血样DNA中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切和PCR鉴定后,进行序列测定,采用BLAST软件分析其特征。结果 PCR扩增出间日疟原虫红内期SSUrRNA基因特异性片段大小约为998 bp;阳性克隆重组质粒经双酶切及PCR鉴定与预期结果一致;核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段,含有998个核苷酸,与GenBank中的间日疟原虫Sal 1株、Pv2008/TR/DEL株及El Salvador株相同序列进行比对,其同源性均大于99%。结论成功克隆间日疟原虫海南株红内期SSUrRNA编码基因序列,该序列在不同地理株间相对稳定保守。     

深圳人群弓形虫感染的血清流行病学调查研究

为了调查目前深圳地区人群弓形虫感染情况 ,本文自 1997年至 1999年采用酶联免疫吸附试验( ELISA)对深圳地区不同人群 12 2 0份血清进行检查 ,结果总人群 Ig G阳性率为 11.15% ,Ig M阳性率为0 .2 5%。其中 ,幼儿组、青少年组、成年组、老年组 Ig G阳性率分别为 2 .33%、 5.68%、 8.90 %、 10 .2 3% ;动物饲养员、屠宰工人的阳性率为 2 3.57%、 2 5.0 0 % ,与阳性率分别为 14 .66%、 7.14 %、 6.32 %、 5.68%的饮食业人员、目前没有与动物接触职业者、医务工作者、中学生之间有显著性差异 ( P<0 .0 0 5) ;男性 Ig G阳性率为 11.73% ,与 Ig G阳性率为 10 .66%的女性比较无差异 ( P>0 .5)。结果显示深圳地区人群感染率有随年龄递增而升高趋势 ,且不同职业之间亦有显著差异性 ,但性别差异无显著性。     

弓形虫P22编码基因真核表达质粒接种小鼠后的细胞免疫效果

目的　观察分析弓形虫表面抗原 P2 2编码基因真核表达质粒 (p BK/P2 2 )接种小鼠诱导的细胞免疫效果。方法　采用肌肉注射免疫接种 BAL B/c小鼠 ,5周后 ,取鼠脾细胞作 Con A刺激淋转试验 (MTT法 )及 T细胞亚群的测定。结果　MTT试验中 ,p BK/P2 2免疫组、空质粒 p BK- CMV对照组与 NS对照组的 Con A孔的光密度值与不加 Con A孔的光密度值的差值疫苗免疫组略高于二对照组 ,统计学分析无明显差异 (P>0 .0 5 ) ;CD+4 细胞数量变化无显著性差异 (P>0 .0 5 ) ,而 CD+8细胞数量则明显增多 ,p BK/P2 2免疫组、空质粒 p BK- CMV均高于 NS对照组 ,其差异有显著性 (P<0 .0 1) ;p BK/P2 2免疫组与空质粒组间无显著性差异 (P>0 .0 5 )。结论　 p BK/P2 2对 Con A刺激的淋巴细胞增殖功能作用不明显 ;T淋巴细胞亚群测定结果表明 ,p BK/P2 2免疫后小鼠 CD+4 淋巴细胞增殖不明显 ,而 CD+8淋巴细胞则显著增殖     

重组SARS冠状病毒N蛋白纯化与鉴定

目的分析重组SARS-CoVN蛋白的表达,并予以纯化。方法SDS-PAGE分析N蛋白的表达,于自动蛋白层析系统上,用His·BindTM柱亲和层析纯化。结果重组表达的N蛋白存在于裂解细菌上清中,分子量大小约49000u,N蛋白经亲和层析获得纯化,纯化蛋白能与病人血清反应。结论表明自动层析获得了纯化良好抗原性的N蛋白。     

重组弓形虫GRA8的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化弓形虫RH株GRA8的截短型片段,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-GRA8中切取GRA8的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达GRA8,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果GRA8基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌中未见GRA8的明显表达;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被弓形虫感染兔血清识别。结论成功构建了GRA8的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

日本血吸虫Calpain序列分析及DNA疫苗体系的构建

目的　探讨日本血吸虫疫苗候选分子 -钙离子激活的中性蛋白激酶 (Calpain)在抗日本血吸虫感染的保护性作用及其保护性免疫机制。方法　从日本血吸虫成虫中提取RNA ,用RT -PCR扩增Calpain含多个B ,T细胞表位的片段 ,引物中包含BamHI和EcoRI的酶切位点 ,PCR扩增产物经纯化后TA克隆 ,转化的阳性TA克隆经PCR筛选后 ,液体培养大肠杆菌并回收质粒DNA ,质粒DNA经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切 ,目的基因亚克隆到真核表达质粒pVAC载体 ,构建 pVAC -Cal pain真核表达体系 ,转化的阳性亚克隆经PCR筛选 ,液体培养大肠杆菌并回收pVAC -Calpain质粒DNA ,质粒DNA经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切和DNA序列分析鉴定被亚克隆的Calpain基因。 结果　RT -PCR从日本血吸虫RNA中扩增了 4 5 3bp的Calpain基因 ,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切和DNA序列分析鉴定Calpain基因被克隆到真核表达质粒 pVAC载体。 结论　日本血吸虫疫苗候选分子Calpain的DNA疫苗体系的建立将有助于解析这个疫苗候选分子抗日本血吸虫感染的保护性免疫作用及保护性免疫机制。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-2DNA疫苗诱导小鼠T淋巴细胞的增殖

目的　为了探讨恶性疟原虫FCC - 1/HN株裂殖子表面蛋白 - 2 (MSP - 2 )DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法　将重组真核表达质粒pBK/MSP - 2经骨骼肌注射BALB/c小鼠 ,小鼠经DNA疫苗免疫 8w后 ,用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化 ,并体外培养脾脏细胞 ,用夹心ELISA法测定IFN -γ和IL - 2的产生。结果　与对照组相比 ,疫苗组CD+ 4CD8+ T淋巴细胞有显著性的增高 ,体外培养的脾脏细胞IFN -γ有一个高浓度的分泌。结论　恶性疟原虫FCC - 1/HNMSP - 2DNA疫苗诱导了一个TH1的免疫应答类型