弓形虫SAG2基因体外扩增、克隆及在耻垢分支杆菌中的表达

目的体外扩增弓形虫RH株表面抗原2(SAG2)基因,并构建大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒ps3000-SAG2,构建重组耻垢分支杆菌,免疫接种小鼠,通过检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体,证明SAG2重组蛋白在耻垢分支杆菌中有表达。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增弓形虫RH株的SAG2基因,克隆入pGEMT载体,然后构建亚克隆ps3000-SAG2大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将SAG2基因的穿梭质粒转化到耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatismc2155)中,用重组耻垢分支杆菌免疫小鼠,Western-blotting方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体。结果成功扩增了弓形虫的SAG2基因;正确构建穿梭质粒ps3000-SAG2,免疫印迹分析,免疫小鼠血清能所识别SAG2重组蛋白。结论耻垢分支杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白SAG2,具有抗原性,刺激小鼠机体产生出了抗弓形虫的抗体,为下一步弓形虫重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析

目的　构建原核重组表达质粒pET23aSAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性。　方法　PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD18T载体,转化大肠埃希菌DH5α。测序后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组表达质粒pET2 3aSAG2,转化大肠埃希菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切分析鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基 βD硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)与免疫印迹分析表达产物。　结果　PCR扩增出约500bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建的pET23aSAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pET23aSAG2重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS PAGE显示表达产物约Mr19000;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性。　结论　成功构建了pET23aSAG2表达质粒,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达;表达产物具有良好的抗原性。     

SARS冠状病毒S蛋白部分序列2的克隆与表达

目的 构建SARS冠状病毒棘突蛋白部分序列2(S2)的原核表达质粒，分析其在大肠杆菌中的表达状况。方法 采用逆转录聚合酶链式反应技术从SARS冠状病毒基因组中扩增出编码S蛋白的第2170到2814位碱基的基因片段，克隆至pMD18-T载体，PCR筛选阳性克隆并测序。用限制性内切酶消化后，目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌．JM109，PCR和双酶切鉴定转化菌落。将阳性菌落经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达。结果 RT—PCR扩增出S2特异片段，经测序与GenBank比对存在1处碱基突变。S2基因片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2构建成重组表达质粒，并在JM109中表达了S2融合蛋白。结论 成功构建了SARS冠状病毒S2的重组表达质粒，并在大肠杆菌中表达了S2融合蛋白。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株裂殖子表面抗原2基因在M.smegmatis mc2155中的表达

目的研究裂殖子表面抗原2(merozoitesurfaceantigen2,MSA2)基因重组BCG疫苗的保护作用.方法采用电穿孔转化法将重组质粒pBCG/MSA2导入耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)mc2155中,通过卡那霉素抗性筛选并经PCR鉴定的重组M.smegmatismc2155培养于middlebrook7H9broth(M7H9)培养基,并添加10%M7H9enrichmentADC和0.05%Tween80,48～72?h后于45℃进行30?min的诱导表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Westernblot分析.结果SDS-PAGE及Westernblot分析结果均显示在相对分子质量(Mr)约31×103的位置上可见明显的蛋白条带,并与MSA2基因编码序列推断的Mr相符.结论恶性疟原虫裂殖子表面抗原2可在M.smegmatis中表达,这些结果将为恶性疟原虫多价BCG疫苗的研制提供有用的资料.     

深圳市华支睾吸虫感染现状的调查

目的 了解深圳市淡水鱼及人群华支睾吸虫的感染现状，分析其流行病学特征，为制订深圳市肝吸虫病防治对策提供科学依据。方法 抽检深圳市各区水产品15个品种257份样品，用消化法筛查淡水鱼华支睾吸虫囊蚴；收集3088份人群血清标本，酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中特异性抗体；描速流行病学分析人群华支睾吸虫感染的血清流行病学特征。结果 淡水鱼样品中检出含华支睾吸虫囊蚴45份，检出率为17．50％。在所抽检的15个品种中检出率较高的鱼种依次为鲩鱼40．74％、鲮鱼26．O％、鲤鱼22．5％、大头鱼22．85％、生鱼16．6％、非洲鲫鱼14．5％；深圳5个区淡水鱼的感染率由高到低是龙岗、宝安、南山、罗湖和福田，分别为26．0％、17．9％、15．0％、14．0％和14．0％；检测3088份血清标本，特异性抗体阳性标本105份，总阳性率3．40％；男性阳性率为3．26％，女性为3．93％；20-29岁、30，39岁、40-49岁与50-81岁各年龄段人群的阳性率分别1．16％、2．44％、4．75％和7．67％。结论 深圳市淡水鱼中华支睾吸虫的感染情况严重，尤其是鲩鱼的感染率较高；人群血清抗体阳性率有随年龄增高而上升的趋势，总阳性率与广东省平均感染水平相比较低。     

弓形虫表面抗原P35重组蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 构建弓形虫R0H株表面抗原P35基因重组表达质粒P35／pGEX-2T，并在大肠杆菌JMl09中进行表达、纯化及鉴定。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从弓形虫CDNA库中扩增出编码P35抗原的基因片段，克隆入表达载体pGEX-2T，并在大肠杆菌JMl09中融合表达，经GSTmp^TM亲和层析柱纯化出P35重组融合蛋白，以SDS-PAGE电泳鉴定纯度、Western-blot鉴定抗原性。结果成功构建了重组表达质粒P35／pGEX-2T，融合表达产物的分子质量约为70kDa；该蛋白抗原能为谷胱甘肽S转移酶(GST)单克隆抗体及弓形虫感染的兔血清所识别。结论弓形虫表面抗原P35在大肠杆菌中有效表达，纯化蛋白有良好的免疫活性。     

弓形虫有效抗原表位的筛选及其对小鼠免疫保护性的研究

目的:利用噬菌体随机肽库技术筛选弓形虫抗原的有效表位，并探讨其免疫保护效果。方法：用纯化的弓形虫免疫兔血清IgC对噬菌体12肽库进行三轮筛选，对获得的日的噬菌体用间接ELISA和Dot—ELISA检测其特异性，并对其中的某些克隆进行Western—blot分析和序列测定；用混和噬菌体克隆及强阳性表位克隆免疫BABL／c小鼠．间接ELISA法测定其特异性抗体滴度，攻击感染后观察小鼠存活情况。结果：经三轮筛选，特异性噬菌体得到富集，随机挑取18个克隆经间接ELISA和Dot—ELISA鉴定，有16个克隆能与弓形虫免疫兔血清IgG呈特异性反应。Western—blot分析显示P2克隆能被免抗弓形虫血清所识别，具有类似于弓形虫抗原的免疫原性，其序列为5’-CTTCAGTTGGATCGGGCTCGGTTTTGGAAT CAGGGT-3’，与GenBank的弓形虫已知序列无一级结构的同源性；与原肽库对照组相比，P2实验组和P总实验组免疫小鼠均能诱导出较高滴度的IgG抗体，抗攻击感染后小鼠的存活率及存活时间也均高于对照组。结论：利用噬菌体随机肽库技术获得了弓形虫抗原的有效模拟睥位，这些表位能诱导对弓形虫的部分保护作用。     

The Immunity Induced by Recombinant Spike Proteins of SARS Coronavirus in Balb/c Mice

The immune effect of two recombinant protein fragments of spike protein in severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS CoV) was investigated in Balb/c mice. Two partial spike gene fragments S1 (322-1464 bp) and S2 (2170-2814 bp) of SARS coronavirus were amplified by RT-PCR, and cloned into pET-23a prokaryotic expression vector, then transformed into competent Escherichia E.coli BL21 (DE3)(pLysS) respectively. Recombinant proteins were expressed and puri- fied by Ni2 immobilized metal ion affinity chromatography. The purified proteins mixed with com- plete Freund adjuvant were injected into Balb/c mice three times at a two-week interval. High titer antibody was detected in the serum of immunized Balb/c mice, and mice immunized with S1 protein produced high titer IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3, while those immunized with S2 protein produced high titer IgG1, IgG2a, but lower titer IgG2b and IgG3. Serum IFN-γ concentration was increased significantly but the concentrations of IL-2, IL-4 and IL-10 had no significant change. And a marked increase was observed in the number of spleen CD8 T cells. The results showed that recombinant proteins of SARS coronavirus spike protein induced hormonal and cellular immune response in Balb/c mice.     

日本血吸虫钙蛋白酶肽链文库的制备及其B细胞表位的筛选

目的 筛选钙蛋白酶（calpain)的B细胞表位，探讨其B细胞表位的免疫原性及其所诱导的免疫应答类型。方法 用Genetyx-MAC9.0分析calpain肽连的亲水性，在亲水性区域以9个氨基酸为肽链单位的固相重叠钛链库（每相邻两个肽链之间仅有一个氨基酸不同）被Auto-spot Robot制备，用Dot-ELISA在合成的肽链库上筛选B细胞表位，含有B细胞表位的肽链免疫BALB／c小鼠，ELISA鉴别特异性IgG抗体亚类的产生。结果 由758个氨基酸组成的日本血吸虫calpain蛋白含有2个主要的亲水区，其存在区域分别在氨基酸229－375和555－613；当我们测定合成的肽链文库时，在亲水区内筛选出4个B细胞的表位，分别是氨基酸234－251（YAHLSGGT）；290－297（CLMGCSIH）；338－346（PWGDSHEW）；358－364（AWCDGAPQ）；与对照组鼠相比较免疫鼠血清中IgG1、IgG2a、IgG2b特异性抗体有显著性意义的上升。结论 日本血吸虫calpain是一个具有免疫原性的蛋白，能够激发宿主产生高水平的免疫球蛋白，提示calpain的B细胞表位可以成为日本血吸虫的诊断抗原和日本血吸虫疫苗候选分子。