实时荧光定量PCR检测HIV-1逆转录酶活性方法的建立

目的 体外模拟HIV-1的逆转录起始过程,建立实时荧光定量PCR测定HIV-1逆转录(RT)酶活性的方法.方法 以人类基因组DNA为模板PCR扩增得到tRNALys+3基因,在其5'端加入T7转录启动子,应用T7 RNA聚合酶转录得到cRNA;以HIV-1感染性克隆为模板PCR扩增得到HIV的5'-LTR-PBS,将其克隆连接至pGEM-T easy载体上,利用SP6 RNA聚合酶转录得到SP6-5'-LTR-PBScRNA;分别应用两种标准RT酶(SuperScript Ⅲ和HIV-1标准RT酶)催化体外逆转录反应合成相应cDNA.实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,进而得出逆转录酶的相对活性.结果 成功获得长度为93 bp的tRNALys-3引物和872 bp的SP6-5'-LTR-PBS RNA模板.将SuperScriptⅢ和HIV-1标准RT酶分别按1:10、1:100、1:1 000、1:10 000比例稀释后催化逆转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的逆转录产物cDNA,其循环阈值分别为13.9、18.3、20.9、24.9和20.4、25.5、28.7、32.5.结论 成功模拟HIV-1逆转录的起始过程并建立了基于实时荧光定量PCR检测RT酶活性的新型方法,为临床治疗、新药筛选和耐药检测提供了参考指标.     

凉山彝族自治州HIV流行毒株基因亚型分析

目的对16例来自凉山彝族自治州的HIV感染者进行亚型分析,监测该地区感染人群HIV毒株的流行情况。方法从16例HIV-1抗体阳性样本中分离外周血单核细胞（PBMC）,从PBMC中提取基因组DNA,直接进行巢式PCR扩增HIVenv基因c2～v5区及gag基因p17～p24区,对PCR产物进行核苷酸序列测定和分析,确定基因亚型。结果 16例样本全部为BC重组亚型,env基因的基因距离较gag基因远,gag基因在进化上与CRF07-BC更为接近。结论凉山彝族自治州的HIV流行毒株主要为CRF07-BC。     

丙肝的治疗进展

对初次治疗的慢性丙型肝炎患者,每周一次聚乙二醇化干扰素(PEG-干扰素)(α-2a或α-2b)加利巴韦林联合治疗是标准方案.此方案比每周三次标准干扰素加利巴韦林联合治疗方案具有更高的持续病毒学应答率(SVR).本文简要介绍了最近研究两种PEG-干扰素对丙肝的疗效,对特殊人群的治疗,如何减少副作用,提高患者对治疗的依从性,提高SVR等研究初步结果.     

1型HIV感染多重PCR检测方法的建立及临床应用

目的建立检测人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的多重巢式PCR(nPCR)和多重反转录PCR(RT-PCR)方法。将其与已经上市的NASBA法试剂盒进行检测敏感性比较;探讨血浆RNA水平对PCR检测敏感性的影响;评价该方法用于我国HIV-1感染者诊断的价值。方法针对HIV-1的gag、pol和gp41区设计3套引物,建立检测HIV DNA的多重nPCR和检测HIVRNA的多重RT-PCR方法;分别以建立的PCR方法和NASBA法对119例HIV阳性患者进行检测,比较2者的检测敏感性;将患者分为不同的病毒载量组,比较PCR方法在各组患者中的检测敏感性差异;使用建立的PCR方法对10例可疑急性感染者进行检测;扩增HIV-1膜区C2-C3段,对nPCR检测阳性的43例DNA样本进行亚型鉴定。结果多重nPCR的检测敏感度为97.5%(116/119),多重RT-PCR的敏感度为78.2%(93/119),2者的特异度均为100%(50/50),多重nPCR和多重RT-PCR的阳性预测值分别为97.5%(116/119)和78.2%(93/119),阴性预测值均为100%(50/50),准确性分别为98.2%和84.6%。经比较,多重nPCR和多重RT-PCR的检测敏感度都高于NASBA法。在病毒载量<103copy/mL的患者,nPCR的检测敏感性高于RT-PCR,在病毒载量在(103～104)copy/mL的患者及病毒载量≥104copy/mL的患者,2者的敏感性比较相近,均接近100%;检测的10例可疑急性感染者中,有5例患者的nPCR和RT-PCR检测结果阳性,抗体在随访过程中阳转,证实为HIV急性感染者;检测的43例DNA样本分属于B’亚型(37例),AE亚型(5例)和BC亚型(1例)。结论本课题组建立的PCR检测方法可以对我国主要流行的B’、AE和BC亚型病毒株得到很好的扩增效果;nPCR的检测敏感性受血浆RNA水平的影响相对较小,RT-PCR的检测敏感性受血浆RNA水平的影响相对较大;PCR方法可以用于HIV急性感染者的早期诊断。     

我国男男性行为人群HIV-1新发感染者亚型及原发耐药分析

目的为了掌握全国男男性行为人群（MSM人群）HIV原发耐药状况,本研究在BED—EIA新发感染筛查阳性者中开展了亚型及耐药性检测。方法采用同伴推动抽样（简称RDS）或分类滚雪球抽样方法在13个省份男男性行为人群中开展抽样调查,确证阳性者进行BED—EIA检测。通过PCR反应和基因测序对214个新发感染样本进行HIV—1亚型及原发耐药分析。结果扩增成功104个样本,CRF01-AE、CRF07-BC和B’亚型分别占62．5％、28．8％和8．7％;耐药突变发生率20．2％,潜在耐药13个、低度耐药6个,中度耐药4个、高度耐药2个;逆转录酶区耐药突变发生率较高;蛋白酶抑制剂、核苷类反转录酶抑制剂、非核苷类反转录酶抑制剂相关耐药突变发生率分别为7．69％、6．73％及10．6％;耐药发生率14．4％。结论我国MSMHIV新发感染人群中原发耐药问题不容忽视,有必要对MSM人群开展治疗前耐药检测;另外,还需加大感染者管理、加强干预力度,以应对我国MSM人群未来可能的艾滋病治疗原发耐药的严峻考验。     

角蛋白K18及33、52位丝氨酸磷酸化的K18在HBV感染肝脏疾病中的表达及意义

目的研究K18及Set33和Set52磷酸化的K18在乙型肝炎病毒感染后肝病不同进程肝组织中的表达及其意义。方法组织化学免疫荧光法检测K18及Set33和Set52磷酸化K18在正常肝组织、乙型肝炎病毒感染后肝硬化及重型肝炎肝组织中的表达及定位。结果K18、Set33和Set52在正常肝组织、乙型肝炎肝硬化及重型肝炎肝组织中都有表达，K18在三种肝组织中表达量没有明显差异，Set33和Set52磷酸化的K18在正常肝组织中的表达基本位于细胞质膜附近，在肝硬化、重型肝炎时表达量增加并弥漫进入细胞质中。结论Set33和Set52磷酸化的K18的表达随着HBV感染后肝脏损伤程度增加而增高，Set33和Set52磷酸化的K18是乙型肝炎病毒感染后肝脏疾病病情进展的标志。     

核苷(酸)类似物加干扰素延长疗程对HBeAg阳性患者HBsAg转换的初探

目的 探讨使用IFN和核苷(酸)类似物联合治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎获得HBsAg血清转换患者的临床特点和作用机制.方法 收集2001年1月至2007年5月使用IFN和拉米夫定或阿德福韦酯联合治疗后出现HBsAg转换的慢性乙型肝炎患者共32例,转阴后定期随访并分析其临床特点.结果 HBV DNA于治疗后3～6个月转阴,初治和复治(包括拉米夫定耐药)患者治疗2年均未见病毒学反弹或新的临床耐药出现.HBsAg转换后平均随访13.2个月,2例出现HBsAg复阳,其中1例抗病毒治疗重新获得HBsAg转换,另1例未再治疗,维持在HBeAg转换状态.余30例患者均维持在HBsAg转换状态.7例治疗后(其中3例治疗前、后两次)行肝穿刺病理和免疫组织化学检查.6例肝内HBsAg及HBcAg均阴性,1例HBsAg免疫组织化学阳性者复发;3例治疗前、后对比肝组织炎性反应和纤维化程度均减轻,其中1例由G2S4变为G1S2～3,该例停用IFN后ALT仍异常,余4例有轻度炎性反应和纤维化.转阴模式有三种,转阴顺序为HBV DNA→HBeAg→HBsAg,占59%(19/32例);HBeAg和HBsAg同步转阴,占31%(10/32例);HBsAg先于HBeAg转阴,占9%(3/32例).治疗1年时血清HBsAg滴度71.4%(15/21例)<100 COI;63.6%(7/11例)<250 IU/L.联合治疗的不良反应基本上同IFN单药治疗.结论 联合治疗和延长疗程是获得HBsAg血清转换的关键.肝组织内HBsAg阳性和血清抗-HBs低水平者易复发.疗程1年时血清HBsAg滴度<100 COI或<250 IU/L可能是HBsAg易转阴的预测指标.     

河南省257例艾滋病一线抗病毒治疗失败患者耐药状况研究

目的 了解河南省一线抗病毒治疗失败的艾滋病患者基因型耐药的状况,并对不同地区患者的耐药情况进行比较.方法 选取2010年河南省3个地区(A、B和C)一线抗病毒治疗失败的艾滋病患者276例,进行CD4+T淋巴细胞、病毒载量和基因型耐药检测,对耐药的发生率和耐药突变位点进行分析.结果 总耐药率为68.48％( 176/257,有19例未成功扩增),非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTIs)的耐药率最高为67.70％,核苷类反转录酶抑制剂(NRTIs)的耐药率为54.09％,蛋白酶抑制剂(PIs)的耐药率为1.18％.A、B和C地区的耐药率分别为82.35％、97.47％和52.80％,3个地区患者的耐药率差异有统计学意义(x2=50.624,P=0.000);NNRTIs和NRTIs的耐药率差异也有统计学意义(x2=48.771,P=0.000;x2=33.912,P=0.000).M184V/I是发生最多的NRTIs类耐药突变位点,发生率为26.46％,A和B地区的M184V/I发生率(47.06％和49.37％)显著高于C地区(13.04％)(x2=39.905,P=0.000),其次是TAMs相关突变,TAMs-1和TAMs-2分别为8.56％和4.28％,C地区的TAMs-1显著少于A和B地区(x2=13.499,P=0.001).≥1 TAM的为40.47％,其中T215Y/F最多,发生率为33.85％.K103N是出现最多的NNRTIs类耐药突变,为31.13％,其在3个地区发生率的差异均有统计学意义(x2=14.213,P=0.001).耐PIs的突变位点有2个,M461/L为1.17％,V82F为0.39％,A地区未出现主要耐PIs的突变位点.结论 河南省不同地区的耐药状况有明显差异,应区别对待,而艾滋病二线抗病毒治疗工作应及时、严格和规范.     

《传染病学》计算机辅助教学积件的开发与应用

围绕本院传染病学教材改革,研制了教学资源素材库和多媒体著作平台的有机整合———积件,制作了一套配合理论课课堂教学和传染病见习教学的多媒体演示系统,。把以往保存的某些传染病典型临床表现的照片和幻灯等珍贵资料转化为数字化形式,通过和互联网的接轨,收集新发传染病的图片、视频资料,形成资料库,使教学免受传染病季节性、地方性、外来性的限制,并弥补病种单一、典型病例减少的缺憾,提高学生的感性认识和学习兴趣,提高教学效果。     

艾滋病，让我们了解的更多（上）

正主持人:老百姓听到艾滋病这个词都会觉得有些可怕,甚至谈"艾"色变。首先想问一下吕教授,艾滋病这个病严重吗?吕繁:艾滋病在我们国家流行已经30多年,从全球来看,在各类疾病当中,目前艾滋病有这样一个特点。首先它是慢性传染性疾病,而且具有致死性。到目前为止,通过科技的发展,虽然有一定的治疗手段,但是仍然不能治愈。所以,从疾病本身的严重程度来看,对人类健康有