人视网膜色素上皮细胞脱分化模型的建立

目的建立人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞脱分化的模型,体外模拟增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）中RPE的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）过程。方法将ARPE-19细胞培养在无血清、含N2和NEAA的petri dish中,建立RPE的EMT模型,采用倒置荧光显微镜观察细胞形态的转变,采用基因芯片和定量PCR来检测EMT相关基因的表达,采用Western blotting和ELISA来检测相关蛋白的表达。结果 ARPE-19细胞在建模后形态明显发生了改变,基因芯片和Q-PCR检测显示一些与EMT相关的因子（如TGF-β1,Vimentin,CD46）及炎症因子（IL-15）和细胞因子（EGF）的表达上调,ELISA在蛋白水平上显示建模后细胞表达的TGF-β1,IL-15,和EGF蛋白明显增多,Western blotting显示Vimentin蛋白的表达也显著上调。结论 ARPE-19在N2和NEAA的petri dish中培养可以诱导EMT的发生。     

VitC对丙烯酰胺诱导小脑损伤的保护作用

目的　探讨大剂量VitC对丙烯酰胺 (ACR)诱导小鼠脑损伤的保护作用。方法　连续小鼠腹腔注射不同剂量ACR(2 5mg/kg·d)为染毒组 ,VitC组在小鼠染毒的同时腹腔注射VitC(5 0mg/kg·d) ,正常对照组以等量生理盐水注射。在用药第 5天、10天分离小脑采用硫巴比妥酸法 (TBA)测定过氧化脂质 (LPO)的含量 ,采用逆转录 聚合酶链反应检测鼠纤粘连蛋白 (fibronectin ,Fn)基因的表达。结果　ACR组小脑LPO与正常对照组比较均有显著差异 (P <0 .0 5 ) ;且低剂量ACR组 (第 5天、10天 )之间 ,VitC组与ACR组比较均有显著性差异 (P <0 .0 5 )。ACR组Fn基因表达明显上调 ,VitC组Fn表达下降。结论　ACR神经毒性与氧自由基增多密切相关 ,VitC能够减轻ACR神经毒作用。ACR对Fn基因表达的影响 ,可能介导其神经毒作用。     

人HSP 70真核载体的构建及其在胆囊癌细胞中的表达

目的构建真核表达载体pcDNA3．0-Hsp70,并在胆囊癌细胞SGC996中进行表达。方法构建真核表达载体pcDNA3．0-Hsp70,经EcoRⅠ及BarnHⅡ双酶切鉴定并测序;通过脂质体法转染SGC996胆囊癌细胞,经G418抗性筛选获得稳定表达细胞株;用流式细胞术检测其表达情况。结果酶切电泳和DNA测序证实载体构建正确;体外转染入SGC996细胞中后,可见转染细胞有Hsp70蛋白的表达。结论成功构建了pcDNA3．0-Hsp70真核表达载体,为研究Hsp70在肿瘤免治疗中的作用奠定了基础。     

单眼剥夺鸽视盖与人CDC10同源基因的克隆与表达分析

初步研究鸽视觉偏侧化的分子机制。建立鸽左侧单眼剥夺模型,采用抑制消减杂交和反Northern方法筛选右视盖差异表达的表达序列标签。自右视盖消减文库随机取60个重组克隆进行反Northern杂交,证实为真阳性克隆6个,随机对其一进行序列分析。发现该片段与人CDC10有84%的同源性。CDC 10属MBF转录因子复合体的一部分,介导细胞周期调节的转录,该表达序列标签在右视盖表达增强,可能调制一些视觉相关神经元的分化、增殖,其与鸽视觉偏侧化的关系需进一步克隆其全序列了解其功能方可定论。     

目标区域测序诊断CRB1突变导致的视网膜变性

目的 研究一例疑是视网膜变性的患儿,进行基因检测并作出明确的基因诊断。方法 常规检查患儿和家属的眼睛,特别是视网膜的情况。收集患者及家庭成员的外周静脉血液,提取基因组DNA。通过目标区域外显子组序列捕获联合新一代测序(简称目标区域测序),利用生物信息学分析筛选出一系列可能的突变,再通过Sanger测序和共分离研究进行验证,从而确定先证者的致病突变。最后,通过PCR和Sanger测序检测突变基因。结果 患儿视力障碍严重,眼底检查所见符合视网膜变性。其他人眼睛正常。基因诊断结果表明,先证者携带CRB1基因的复合杂合性致病突变(c.3521G>C和c.1141_1142 insTGGCT)。这两个突变分别来源于父亲(c.3521G>C, p.C1174S)和母亲(c.1141_1142insTGGCT),为隐性遗传。患儿的弟弟(新生儿)只有一个c.1141_1142 insTGGCT突变,表明他不会发病。建议新生儿长大后在生育前要进行遗传检查和咨询。结论 目标区域测序的基因诊断方法是检测视网膜变性疾病突变基因的强大工具,有利于对患者做出早期、明确、分子水平的诊断,在特定疾病的理解、预防和预后判定方面能发挥重要作用。同时为其尚无法做临床检查和诊断的新生儿弟弟进行了基因诊断,通过预测,排除了发病的可能。     

VitC对丙烯酰胺急性中毒小鼠脑bax和bcl—2基因表达的影响

目的　研究VitC对丙烯酰胺 (acrylamide ,ACR)诱导小鼠脑损伤的保护作用。 方法　染毒组小鼠连续腹腔注射不同剂量ACR 2 5mg/ (kg·d)和 5 0mg/ (kg·d) ,VitC组在小鼠染毒的同时腹腔注射VitC 5 0mg/ (kg·d) ,正常对照组以等量生理盐水注射。在不同时间分别分离大脑、小脑 ,采用硫巴比妥酸法 (TBA)测定过氧化脂质 (lipoper oxidation ,LPO)的含量。采用逆转录 -聚合酶链反应检测低剂量ACR鼠第 5天、第 10天小脑bax和bcl 2基因的表达。结果　大脑、小脑LPO除高剂量ACR组第 3天与正常对照组无差异 ,其他ACR组与正常对照组比较差异均有显著性 (P <0 .0 5 ) ;且低剂量ACR组 (第 5天、第 10天 )之间 ,高剂量ACR组 (第 3天、第 5天 )之间差异有显著性(P <0 .0 5 ) ;VitC组在高剂量ACR组第 3天与高剂量ACR组无差异 ;其他相对应的VitC组与ACR组比较差异均有显著性 (P <0 .0 5 )。ACR组bax基因表达明显上调 ,VitC组bax表达下降 ,ACR组bcl 2基因表达较正常组明显增高 ,VitC组bcl 2基因表达较ACR组降低。结论　ACR神经毒性与氧自由基增多密切相关 ,VitC能够减轻ACR神经毒作用。ACR对bax和bcl 2基因表达的不同影响 ,可能介导其神经毒作用。     

活性依赖性神经保护蛋白同源基因在帕金森病模型鼠脑中的表达

帕金森病 (PD)是以震颤、强直、运动迟缓为特征的中枢神经系统疾病 ,主要病理变化为黑质致密部多巴胺能神经元变性。PD是中老年人常见的致残疾患 ,备受关注。近年发现将活性依赖性神经保护蛋白 (ADNP)加入神经细胞培养基中 ,可抵御某些毒性物质对神经细胞的伤害 ;在小鼠及大鼠体内实验亦显示有预防脑损伤作用〔1〕。我们于2 0 0 1年 6月至 2 0 0 2年 4月制备类似PD症状的大鼠模型 ,旨在探讨ADNP的表达量与PD病变有无关系。　　一、材料与方法　　 1.PD样脑损伤动物模型的建立 :7周龄雄性C5 7BL小鼠 10只 (本校动物中心提供 ) ,实验…     

GMFB在高糖处理的Müller细胞中的表达及其对Müller细胞的影响

目的:利用高糖处理Müller细胞,研究高糖条件下胶质细胞成熟因子B(glia maturation factor-β,GMFB)的表达情况和GMFB对Müller细胞的影响,揭示GMFB细胞在糖尿病视网膜病变中可能的作用机制,为糖尿病视网膜病变的治疗提供新的策略。方法:(1)用25mmol/L葡萄糖处理Müller细胞0,1,2,4和6 h,采用Western Blot检测GMFB的表达;(2)用自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)感染Müller细胞后,1μg/ml重组蛋白GMFB处理Müller细胞0,2,4,8,12 h,采用Western Blot和免疫荧光检测自噬情况;(3)1μg/ml GMFB处理Müller细胞24 h为实验组,以未处理组作为对照组,进行RNAseq,检测其基因差异表达谱,选取其中表达差异大于1.5倍且P0.05的基因作为差异表达的基因,对其进行基因本体论(gene ontology,GO)分析及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。结果:(1)经高糖处理的Müller细胞早期出现GMFB表达上调,以2 h处理组的GMFB上调最为显著,提示高糖刺激早期能引起Müller细胞的GMFB表达升高;(2)重组蛋白GMFB处理Müller细胞后,Western Blot在第4 h检测到自噬被诱导,但很短暂。我们在24 h用免疫荧光检测,没有发现红绿荧光强度变化,提示双标自噬系统检测未检测到自噬发生,可能与不同检测方法的敏感性不同有关。(3)对GMFB处理24 h的Müller细胞抽提总RNA,进行RNAseq检测,显示在被检测的14411个基因中,实验组和正常组间有显著差异表达的基因有152个。与对照组相比,实验组基因表达显著上调的有103个,下调的有44个。通过GO分析表明,GMFB与细胞代谢、细胞催化等生物过程相关。KEGG分析进一步发现GMFB与细胞黏附分子、轴突导向和胞质DNA感受通路等多条信号通路密切相关。同时,炎症基因IL-33表达降低,提示GMFB有神经保护的作用。结论:GMFB在高糖诱导的Müller细胞中表达明显上调,说明GMFB可能影响细胞间连接,参与炎症反应信号通路等。该工作为理解GMFB在糖尿病视网膜病变中的作用机制提供了有益的线索。GMFB在糖尿病视网膜病变的作用机制需要进一步验证。     

胆固醇酯转移蛋白TaqIB基因多态性与辛伐他汀对冠心病患者血脂调节作用的关系

目的:探讨胆固醇酯转移蛋白TaqlB基因多态性与辛伐他汀对冠状动脉(冠脉)粥样硬化性心脏病患者血脂调节作用的关系.方法:对147例急性冠脉综合征(ACS组)患者、99例稳定冠心病(组)患者及42例经冠脉造影排除冠心病的患者(对照组)进行研究.采用酶法测定血脂各项水平,采用多聚酶链反应一限制性内切酶片段长度多态性分析冠心病患者胆固醇酯转移蛋白基因中TaqlB基因多态性.冠心病患者予辛伐他汀调脂3个月后复查血脂.采用方差分析法比较TaqIB基因组间调脂疗效有无差异.结果:血浆血脂水平变化:可见ACS组与稳定冠心病组血浆总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及脂蛋白(a)水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05～0.01).辛伐他汀调脂治疗前后对冠心病患者血脂水平的影响:可见经辛伐他汀治疗3个月后,血浆总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯(仅B282)、脂蛋白(a)(tZ BlB2)水平较治疗前均降低,差异有统计学意义(P<0.05～0.01).冠心病患者胆固醇酯转移蛋白TaqIB基因型与等位基因对辛伐他汀调脂作用的影响:132132组患者经辛伐他汀调脂治疗后,血浆甘油三酯有了显著降低,且与B1携带者(包括B182组和B1B1组)差异有统计学意义(P<0.01).结论:基因型B182与B1B1比较,血浆高密度脂蛋白胆固醇水平显著增高.B2B2患者经辛伐他汀调脂治疗后,血浆甘油三酯水平显著降低.提示辛伐他汀对冠心病患者的血脂调节作用与胆固醇酯转移蛋白Taq IB基因多态性具有相关性.     

BDNF对诱导分化的SH-SY5Y细胞G1期相关蛋白表达的影响

研究不同浓度的脑源性神经营养因子(BDNF)在体外诱导SH-SY5Y细胞分化时对G1期细胞周期相关蛋白表达的影响。采用全反式维甲酸(RA)和低(1ng/ml)、中(10ng/ml)、高(100ng/ml)三种不同浓度BDNF在无血清培养液中相继诱导SH-SY5Y细胞分化,形成均一的具有神经元形态的细胞。以实时定量RT-PCR法检测G1期细胞周期相关蛋白(包括cdk4,cdk6,cyclin D1,Cyclin E,p16和p27)的mRNA水平的表达变化。结果显示:不同浓度的BDNF处理后,Cdk4mRNA的表达水平均低于未分化细胞组(P<0.05);Cdk6和Cyclin D1的mRNA表达水平与RA组比较显著降低(P<0.05),Cyclin E和p16的mRNA表达水平仅在高浓度BDNF处理后明显降低,与未分化组比较P<0.05,p27的mRNA表达水平无显著变化。以上结果提示BD-NF在诱导SH-SY5Y细胞分化的同时无意促使其再进入细胞周期。同时,用RA预处理5d后改换BDNF培养SH-SY5Y细胞,可使细胞展现出成熟神经细胞的形态,是体外研究某些脑疾病的理想细胞模型。