随机引物引导的乙型肝炎病毒DNA探针标记和重复杂交

随机引物引导的探针标记足一种比切中移位更为有效的探针标记方法,作者应用这种方法制备~(32)P标记的乙型肝炎病毒(HBV)DNA探针。经液闪测定,探什比放射性为lxl0~(9)cpm/ug,(32)P掺入率为71.43％,均比切口移位有关参数上限高出数倍。将这种探针用于尼龙膜载样杂交,在每100cm~(2)的样膜所加探针放射性强度为5 x10~(6)cpm、浓度为20ug/L条件下,放射自显影24小时即可出示清晰结果。并且检出HBV DNA灵敏度达0.1Pg,检测HBSAg和HBCAg双阳性血清,HBVDNA阳性率达87％(26/30)。用这种方法还制备地高辛素标记的HBV DNA探针,并在探针浓度为20 ug/L条件下,对~(32)p探针杂交过的样膜重复杂交。结束检出HBV DNA灵敏度为0.05 Pg,检测HBsAg和HBeAg双阳性血清,HBV DNA阳性率为73％(22/30)。上述结果表明随机引物引导标记可用于制备高比放同位素探针和高敏感性非同位索探针。前者对研究微量基因必不可少,后者对基层单位常规开展检测非常重要。     

慢性乙型肝炎患者的HCV重叠感染

研究45例慢性乙型肝炎患者的HCV重叠感染。病例均为后发抗HCV阳性的慢性HBsAg携带者,无先抗HCV阳性而后HBsAg阳性的个案,这可能反映HBV和HCV两种病毒感染的先后次序、不同传播方式及HBV对HCV易感性的增进作用。用RT-PCR检出30/45例血浆HCV RNA阳性,不仅确证HCV重叠感染诊断,还证实HCV复制及传染性。23/30例HCVRNA阳性者有输血史,提示输血是其获得HCV重叠感染的主要途迳。用PCR检出25/45例血清HBV DNA阳性,其中抗HBe阳性者的HBV DNA检出率为42.9％(12/18),明显低于(P<0.001)我们前文报道,提示重叠HCV感染对HBV复制有抑制作用。此外有9例抗HBe阳性者,其HBV DNA阴性但HCV RNA阳性,反映HCV可能已取代HBV成为致肝损害的主要病因。     

非甲非乙型肝炎(丙型肝炎)病毒序列检测

实验诊断表明,60～90%的输血后肝炎既非甲型肝炎又非乙型肝炎,曾归之为病原未明的非甲非乙型肝炎(NANBH)。仅美国每年就有20～30万人罹患该病,50%会发展为慢性。该病现定名为丙型肝炎,病原     

Nested PCR检测HBV DNA技术的建立与应用

本研究建立一种Nested PCR技术检测HBV DNA,即采用内外两对引物分别进行连续两次扩增,使检测极限由一次PCR的10~(-2)Pg提高到10~(-5)Pg;经~(32)P标记寡核苷酸探针作Southern转移杂交以及BgIⅡ作酶切分析证实两次扩增均为特异性扩增。通过抗-HBe阳性、单项抗一HBc阳性和单项抗-HBs阳性三种血清的HBV DNA的检测,表明该方法确能检出标准PCR所不能检出的极低水平的HBV感染,对提高乙型肝炎的诊断水平及更准确地评价药物疗效有重要意义。     

地高辛素标记乙型肝炎病毒DNA探针的制备及应用

采用随机引物法以地高辛素标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dig-II-dUTP)标记克隆的乙型肝炎病毒(HBV)DNA adw/pAM6,制得高特异性和高敏感性的HBV DNA探针。用于斑点杂交检测HBV DNA,最大敏感度为0.lpg。用于检测HBsAg阳性血清,HBV DNA阳性率为82.7％(91/110),与市售同类药盒相比,阴阳结果一致,与缺口翻译的生物索探针相比,检出率有显著提高(P<0.01)。用于肝癌组织与血清HBV DNA研究,与既往用~32P探针所得结果相符。该探针操作简单、使用方便、出结果快速、价格便宜又无需特殊设备,故适于在临床单位尤其是基层医疗单位应用推广。     

人CD23基因的亚克隆与部分序列测定

已构建的ＣＤ２３ｃＤＮＡ全基因克隆ｐＢＣＤ９７６，以ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ双酶切，回收ＣＤ２３全基因，定向插入ｐＵＣ１８载体，构建ｐＵＣ１８－ＣＤ２３全基因重组体（ｐＵＣｄ９７６）。进一步利用该基因中第３９９位的ＨｉｎｄⅡ酶切点，在ｐＵ１８中构建了ＣＤ２３Ｎ端４０３ｂｐ和Ｃ端６０７ｂｐ的二个亚克隆，分别称为ｐＵＣＤ４０３Ｎ和ｐＵＣＤ６０７Ｃ。并对ｐＵＣＤ６０７Ｃ进行测离，最终确认其为ＣＤ２３基因。     

HCV 5‘—NCR序列克隆和转录重组质粒构建

选取ＩＶ基因型ＨＣＶ及中国和台湾代表株ＨＣＶ的５’ＮＣＲ区保守序列合成引物，以ＲＴ－ＰＣＲ从输血后非甲非乙型肝炎病人血浆中扩增一段３００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段作目的基因，钝端插入ｐＵＣ１９的Ｓｍａ１切点，构建了ｐＵＨＣＶ－ＮＣ重组质粒。对ｐＵＨＣＶ－ＮＣ分别或混合应用ＨＣＶ序列特异的内外引物和载体序列特异的通用引物进行ＰＣＲ扩增，所得产物分子阳均同预期相符；酶切分析查出ＨＣＶ基因所带和克隆位点融合所产     

聚合酶链反应技术结合酶切杂交研究单项抗乙型肝炎…

以聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增单项抗乙型肝炎病毒核心抗原阳性血清的乙型肝炎病毒ＤＮＡ。内外两对引物均选自ａｄｒ、ａｄｗ和ａｙｗ３种亚型ＨＢＶ基因组Ｃ基因区的共有序列，扩增产物分别长４２８ｂｐ和６６４ｂ０ｐ，共含一个Ｂｇ１Ⅱ酶切点，酶切后前者产生２９９ｂｐ和１２５ｂｐ、后者产生４０６ｂｐ和２５４ｂｐ各一个限制性片段。以另一条基因位置处于内引物对之间的寡核苷酸制备３２ｐ－５’末端标记的探针对之进行Ｓｏｕ     

HPLC法测定头孢克洛胶囊含量

目的:建立HPLC法测定头孢克洛胶囊含量。方法:色谱柱:Cosmosil ODSC18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相:磷酸二氢钾溶液-乙腈(90∶10),流速:1 mL/min,检测波长:254 nm,进样量20μL。结果:头孢克洛在0.0564~0.2820 g/L浓度范围内线性关系良好,r=0.9998,平均回收率为99.26%,RSD为0.81%(n=9)。结论:该方法快速、灵敏、准确、可靠,适用于头孢克洛胶囊的含量测定。