人瘦素基因克隆与序列测定

目的 构建人瘦素基因ｃＤＮＡ克隆，并进行序列分析。方法 用逆转录聚合酶链反应扩增人瘦素基因ｃＤＮＡ获得片段（６４０ｂｐ）连接至ｐＵＣ１９载体，并转化大肠杆菌ＤＨ５α。以末端终止法进行序列测定。结果 所克隆的人瘦素ｃＤＮＡ含全长的人瘦素基因编码区，仅２８７位的腺苷酸被鸟苷酸代谢，导致９６位编码谷氨酰胺的密码子ＣＡＡ改变为编码精氨酸的ＣＧＡ，其意义尚待阐明。结论 以逆转录聚合酶链反应方法成功地构建了人     

原发性肝癌10966例外科治疗分析

目的探讨原发性肝癌外科治疗的临床经验。方法回顾性分析1986年1月至2019年12月南京医科大学第一附属医院肝胆中心手术治疗的10966例原发性肝癌患者的临床资料。采用寿命表法进行生存率和肿瘤复发率的计算,Log-rank检验比较不同组别的差异,采用Cox回归模型进行多因素分析。选取2009—2019年随访数据更详尽的2884例肝细胞癌病例纳入长期生存分析,其中接受肝切除患者2549例,男性2107例,女性442例,年龄(56.6±11.1)岁(范围:20~86岁);接受肝移植患者335例,男性292例,女性43例,年龄(51.0±9.7)岁(范围:21~73岁)。比较肝切除与肝移植的效果、解剖性肝切除与非解剖性肝切除的效果等。结果10966例原发性肝癌患者中,10331例行肝切除,635例行肝移植。根据收治时间,将10331例行肝切除的原发性肝癌患者分为3组:1986—1995年组(712例)、1996—2008年组(3988例)、2009—2019年组(5631例)。1986—1995年组肝细胞癌肝切除患者的5年生存率为32.9%。2009—2019年组原发性肝癌患者肝切除后5年总体生存率为51.7%,其中肝细胞癌、肝内胆管细胞癌和混合性肝癌的5年总体生存率分别为57.4%、26.6%和50.6%。进一步分析行首次肝切除的肝细胞癌患者(2549例),其1、3、5、10年累积总体生存率分别为88.1%、71.9%、60.0%、41.0%,围手术期病死率为1.0%;行一期肝移植的肝细胞癌患者247例,1、3、5、10年累积总体生存率分别为84.0%、64.8%、61.9%、57.6%,行补救性肝移植88例,1、3、5、10年累积总体生存率分别为86.8%、65.2%、52.5%、52.5%,两组患者总体生存率的差异无统计学意义(P>0.05)。2549例接受首次肝切除和247例接受一期肝移植患者的总体生存率和复发率相比,符合米兰标准的肝切除和肝移植患者的1、3、5、10年总体生存率分别为96.3%、87.1%、76.9%、54.7%和95.4%、79.4%、77.4%、71.7%(P=0.754),1、3、5年复发率分别为16.3%、35.9%、47.6%和8.1%、11.7%、13.9%(P<0.01);超米兰标准无大血管侵犯的肝切除和肝移植患者的1、3、5、10年总体生存率分别为87.2%、65.9%、53.0%、33.0%和87.6%、71.8%、71.8%、69.3%(P=0.003),1、3、5年复发率分别为39.2%、57.8%、69.7%和29.7%、36.7%、36.7%(P<0.01);超米兰标准有大血管侵犯的肝切除和肝移植患者的1、3、5、10年总体生存率分别为62.1%、36.1%、22.2%、15.0%和62.9%、31.8%、19.9%、0(P=0.387),1、3、5年复发率分别为61.5%、74.7%、80.8%和59.7%、82.9%、87.2%(P=0.909)。影响肝细胞癌肝切除患者生存率及无复发生存率的独立预后因素有性别、术前辅助治疗、症状、AST、术中或术后输血、肿瘤数目、肿瘤最大径、肝硬化、大血管侵犯、微血管侵犯和病理分化(P值均<0.05)。采用倾向性评分匹配法匹配解剖性肝切除和非解剖性肝切除患者资料,得到443对病例,非解剖性肝切除术后患者的生存率与解剖性肝切除的差异无统计学意义(P=0.895),但非解剖性肝切除术后患者的复发率高于解剖性肝切除(P=0.035)。结论近十年,肝癌手术治疗的生存率较之前明显升高。对于肝功能储备较好的肝细胞癌患者可以先行切除手术,复发后再行补救性肝移植,补救性肝移植的效果与一期肝移植相当。在确保阴性切缘的前提下可以选择保留更多肝脏组织的非解剖性肝切除。     

Th17细胞在移植排斥反应中的作用

以往认为,参与细胞免疫的CD4+T淋巴细胞可分为Th1和Th2等细胞亚群,他们各自以不同的角色参与免疫应答.近年来,研究发现了一类新型的效应性T淋巴细胞亚群Th17细胞.     

建立检测血清HBV DNA的多聚酶链反应技术

建立检测血清HBV DNA的多聚酶链反应技术。人工合成adr、adw和ayw三个业型HBV的两个共有序列NC1和NC2作为引物扩增一长428bp且含一BglⅡ酶切点的HBV C基因片段。含FD酶的反应体系在水浴93℃30秒、55℃60秒、72℃90秒依序循环30周期,当克隆HBV DNA模板最小加量为10 fg时,产物作琼脂糖凝胶电泳经溴化乙锭染色在紫外线下观察仍可见428 bp位置的阳性荧光带。阳性产物经BgⅠⅡ酶切后分为125 bp和303 bp的两个特异片段。同一条件下的阴性对照则出现阴性结果。这一技术用以检测经常规DNA提取的127例HBsAg阳性血清,结果HBV DNA检出率达88％,其中HBeAg阳性血清HBV DNA检出率为97％,抗HBeAg阳性血清HBV DNA检出率为82％。     

HCV定量RT—PCR竞争性参比标准的构建

将克隆的ＨＣＶ５‘ＮＣＲ序列反向插入ｐＳＰ７２的Ｅｃｏ ＲＶ切点，构建一种能转录ＨＣＶ－ＲＮＡ的质粒ｐＳｎｃ－２。以ＲＴ－ＰＣＲ从抗ＨＥＶ ＩｇＭ阳性病人血浆中扩增一段２３８ｂｐ的ＨＣＶ－ｃＤＮＡ反向插入ｐＳｎｃ－２中克隆的５’ＮＣＲ序列的ＮｃｏＩ切点，构建插入突变型ＨＣＶ－ｃＤＮＡ重组体ｐＳｎｃ－ｅ。     

石蜡分隔的热启动PCR技术扩增血清HBV-DNA

将聚合酶链反应（ＰＣＲ）成份分两组。先加一组含ｄＮＴＰｓ、引物和ＭｇＣｌ２，并加１粒组织切片用石蜡凝固为盖层。再加另一组反应液含待扩增模板、ＴａｑＤＮＡ聚合酶和ＫＣｌ，以与第一组反应液分隔。ＰＣＲ循环时高温可使中隔蜡层融化，两组反应液相混，蜡油上浮作为防蒸发屏障。由此避免室温混合加样和预置导致引物聚体形成和错导非特异扩增，提高ＰＣＲ特异性和灵敏性。作者应用这一技术检测５３例单项抗ＨＢｃ阳性血清，检出ＨＢＶＤＮＡ１３例，检测６９例ＨＢｓＡｇ阳性和抗ＨＢｅ阳性血清，检出ＨＢＶＤＮＡ６１例。而同样样本用标准ＰＣＲ检测，ＨＢＶＤＮＡ阳性分别为１０例和５２例。两种方法对ＨＢｓＡｇ和抗ＨＢｃ双阳性血清的ＨＢＶＤＮＡ检出率差别有显著意义（Ｐ＜０．０５）。     

随机引物引导的乙型肝炎病毒DNA探针标记和重复杂交

随机引物引导的探针标记足一种比切中移位更为有效的探针标记方法,作者应用这种方法制备~(32)P标记的乙型肝炎病毒(HBV)DNA探针。经液闪测定,探什比放射性为lxl0~(9)cpm/ug,(32)P掺入率为71.43％,均比切口移位有关参数上限高出数倍。将这种探针用于尼龙膜载样杂交,在每100cm~(2)的样膜所加探针放射性强度为5 x10~(6)cpm、浓度为20ug/L条件下,放射自显影24小时即可出示清晰结果。并且检出HBV DNA灵敏度达0.1Pg,检测HBSAg和HBCAg双阳性血清,HBVDNA阳性率达87％(26/30)。用这种方法还制备地高辛素标记的HBV DNA探针,并在探针浓度为20 ug/L条件下,对~(32)p探针杂交过的样膜重复杂交。结束检出HBV DNA灵敏度为0.05 Pg,检测HBsAg和HBeAg双阳性血清,HBV DNA阳性率为73％(22/30)。上述结果表明随机引物引导标记可用于制备高比放同位素探针和高敏感性非同位索探针。前者对研究微量基因必不可少,后者对基层单位常规开展检测非常重要。     

慢性乙型肝炎患者的HCV重叠感染

研究45例慢性乙型肝炎患者的HCV重叠感染。病例均为后发抗HCV阳性的慢性HBsAg携带者,无先抗HCV阳性而后HBsAg阳性的个案,这可能反映HBV和HCV两种病毒感染的先后次序、不同传播方式及HBV对HCV易感性的增进作用。用RT-PCR检出30/45例血浆HCV RNA阳性,不仅确证HCV重叠感染诊断,还证实HCV复制及传染性。23/30例HCVRNA阳性者有输血史,提示输血是其获得HCV重叠感染的主要途迳。用PCR检出25/45例血清HBV DNA阳性,其中抗HBe阳性者的HBV DNA检出率为42.9％(12/18),明显低于(P<0.001)我们前文报道,提示重叠HCV感染对HBV复制有抑制作用。此外有9例抗HBe阳性者,其HBV DNA阴性但HCV RNA阳性,反映HCV可能已取代HBV成为致肝损害的主要病因。     

非甲非乙型肝炎(丙型肝炎)病毒序列检测

实验诊断表明,60～90%的输血后肝炎既非甲型肝炎又非乙型肝炎,曾归之为病原未明的非甲非乙型肝炎(NANBH)。仅美国每年就有20～30万人罹患该病,50%会发展为慢性。该病现定名为丙型肝炎,病原