基于质谱的蛋白质组学诊断所面临的挑战

过去的几年中,基于质谱技术的蛋白质组学分析方法已经成为寻找新的疾病标志物的重要手段之一.由于它具有高灵敏度、高通量、快速以及能和生物信息学技术结合同时快速分析大量的蛋白质或多肽的优点,使之成为临床研究的有力工具.然而,最近的一些研究显示,因为这项技术的重复性和数据统计分析等方面的不足而受到了争议.本文介绍了采用该方法进行标志物筛查时在实验设计、质谱技术以及数据分析等方面面临的一些挑战,探讨其在血清或血浆分析中的应用.     

焦磷酸测序法快速检测胰腺癌K-ras基因点突变

目的 建立基于焦磷酸测序技术的胰腺癌K-ras基因点突变的检测方法,并与Sanger测序法作一比较.方法 用焦磷酸测序法(Pyrosequencing)和Sanger测序法(Sanger sequencing)分别在10名正常胰腺组织、49例胰腺癌、11例慢性胰腺炎、18例胰腺良性囊肿、7例胰岛素癌、9例壶腹癌、7例胆管癌及7例十二指肠乳头癌石蜡包埋组织的DNA中检测K-rag基因12密码子点突变.结果 采用上述两种方法在所有正常胰腺组织、慢性胰腺炎、胰腺良性囊肿、胰岛素癌、壶腹癌、胆管癌及十二指肠乳头癌均未见K-ras基因点突变,而采用焦磷酸测序法发现胰腺癌石蜡包埋组织K-ras基因点突变率为71.4%(35/49),显著高于采用Sanger测序法发现胰腺癌石蜡包埋组织K-rag基因点突变率(61.2%,30/49).结论 焦磷酸测序法较Sanger测序法更为敏感,且焦磷酸测序法准确、快速、高通量,适合临床标本的批量测定.     

六年间血流感染的金黄色葡萄球菌的分子特征分析

目的 分析上海三级甲等医院2004-2010年血流感染的金黄色葡萄球菌克隆分型特点以及随时间的变化趋势,检测不同克隆株耐药和毒力基因携带情况.方法 收集上海华山医院2004-2010年从不同患者血液样本中分离鉴定的金黄色葡萄球菌103株,通过苯唑西林MIC测定和SCCrnec基因分型等方法对MRSA进行检测;按照国际通用的多位点保守基因测序(MLST)以及葡萄球菌A蛋白序列分析(spa typing)方法进行克隆株的鉴定分析,采用PCR方法对103株细菌的耐药以及毒力基因携带情况进行分析.结果 103株金黄色葡萄球菌共检出MRSA66株(64.1%),其中SCCmecⅡ型35株,SCCmecⅢ型29株,SCCmecⅣ型2株,MSSA 37株(35.9%).66株MRSA的克隆分型以ST5(33株)和ST239(29株)为主,另外还包括2株ST59.1株ST641,1株ST6;其他克隆型均为MSSA.从2009年开始ST5和ST239克隆株在血流感染中的分离率明显下降(ST5从52.9%降至15.4%;ST239从61.1%降至15.4%),而其他类型以及新出现的MSSA克隆株分离率明显增加(如2009年ST7分离率为41.7%;2010年新出现ST188及ST15等),2010年血流感染的MSSA为84.6%.103株金黄色葡萄球菌mupA耐药基因阳性19株(18.4%),qacA/B耐药基因阳性41株(39.8%),70.6%的ST239杀菌剂耐药基因qacA/B阳性.在这103株血流感染的金黄色葡萄球菌中发现5株动物来源的克隆株,分别为4株ST398以及1株ST9.22个毒力基因除了sasX、lukSF以及arcA外,同一克隆株无论MRSA还是MSSA其毒力基因携带情况无明显差异,但是不同克隆株携带毒力基因有明显的差异.结论 以ST5和ST239为主的MRSA在血流感染中的分离率明显下降,新的MSSA克隆株分离率明显增加,不同的克隆株耐药以及毒力基因的携带情况存在明显差别.     

慢性肾功能不全患者1d内不同时间点尿总蛋白/肌酐比值的变化情况分析

目的 研究随机尿总蛋白(TP)/肌酐(Cr)比值在1 d中不同时间点的变化情况.方法 选择临床建议做24 h尿蛋白检测慢性肾功能不全患者28例,所有患者随机尿内生肌酐清除率(Ccr)均＞10 mL/min.在常规收集24 h尿样本时,分段收集随机尿样本(取出1.5 mL,其余倒入24 h尿定量收集的容器内).检测每份样本的24 h尿及随机尿TP和Cr,并计算出TP/Cr比值.取高、中、低3个浓度的24 h蛋白尿样本各1份重复检测,获得该方法的室内误差值,即批间变异系数(CV).结果 TP、TP/Cr比值高值、中值和低值的CV均＜5%,在临床可接受范围内.28例患者中有11例(40%)患者1 d内随机尿TP/Cr比值波动幅度很小,与24 h TP/Cr比值很接近(P>0.05).此类患者可用随机尿TP/Cr比值来推测24 h尿蛋白量.另有17例(60%)患者1 d内随机尿TP/Cr比值波动幅度很大,随机尿TP/Cr比值波动与24 h尿TP/Cr比值的实验误差(按临床最大可接受范围计算)引起的波动之间存在明显差异(P<0.05);而且一些患者的随机尿TP/Cr比值会出现极端变化,差异甚至可高达30倍.对这60%的患者用任意一次随机尿TP/Cr比值来推测24 h尿蛋白量很难得到正确结果,即该类患者的随机尿TP/Cr比值不能用于代替24 h尿蛋白检测.部分患者即使24 h尿蛋白水平已明显异常,而多次随机尿中UP及TP/Cr比值却在正常范围内,出现假阴性结果.结论 大多数患者1 d中随机尿TP/Cr比值的变化较大,建议在有条件的情况下最好采用24 h尿TP评估肾脏蛋白漏出.     

整合子中氨基糖苷-3″-腺苷酰基转移酶多克隆抗体的制备与初步应用

目的 制备氨基糖苷-3″-腺苷酰基转移酶[AAD(3″)]特异性抗血清,并探讨其在检测第1类整合子8种不同可变区启动子(PcS、PcH2、PcH1、PcW、PcS-P2、PcH2-P2、PcH1 -P2和PcW-P2)下游基因盒中aadA2基因表达水平的应用价值.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增aadA2基因,并克隆至表达载体pET19b中,诱导表达并纯化带组氨酸标签的重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔制备抗AAD(3″)特异性抗血清.以制备的抗AAD(3″)抗血清为一抗,用免疫印迹法(WB)检测不同可变区启动子下游基因盒中aadA2基因的翻译水平,用微量肉汤稀释法检测链霉素对含不同可变区启动子及其下游aadA2基因盒的大肠埃希菌JM109的最低抑菌浓度(MIC).结果 成功构建重组的AAD(3″)蛋白表达质粒pET1 9b-aadA2,经测序确认转化大肠埃希菌BL21( DE3)获得1株高表达可溶性重组AAD(3″)蛋白的工程菌株,发酵后用镍柱纯化获得纯度＞90％的重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔获得效价＞ 1∶100 000的抗AAD(3″)特异性抗血清.WB检测8种不同可变区启动子下游aadA2基因翻译产物AAD(3″)蛋白的表达水平,设定启动子PcW下游AAD(3″)蛋白的相对表达水平为1,重复3次测得启动子PcS、PcH2、PcH1、PcS-P2、PcH2 -P2、PcH1-P2及PcW-P2下游AAD(3″)蛋白相对表达水平依次为12.9±2.3、9.1±1.0、2.0±0.4、16.0±1.3、14.1±1.3、10.5±0.7、8.9±1.7,且不同可变区启动子下游AAD(3″)蛋白的相对表达水平差异具有统计学意义(F=32.421,P＜0.01).微量肉汤稀释法重复3次测得链霉素对含启动子PcS、PeH2、PcH1、PcS-P2、PcH2-P2、PcH1 P2、PcW、PcW-P2及其下游aadA2基因重组质粒的大肠杆菌JM109的MIC平均值依次为256、256、64、128、32、128、4、64 mg/L,表明不同可变区启动子下游aadA2基因的表达水平不同可赋予宿主细菌对链霉素产生不同水平的耐药.结论 成功纯化出可溶性重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔获得高效价的抗AAD(3″)特异性抗血清,为进一步研究整合子中整合酶基因与可变区基因盒表达之间的相互关系奠定基础.不同可变区启动子下游耐药基因盒的表达水平明显不同,赋予宿主细菌对相应抗菌药物的耐药水平明显不同,因此在对临床菌株进行第1类整合子分子流行病学调查时,应重视可变区启动子分类方面的研究.     

上海市常规化学项目检验结果互认基础探讨

目的分析2010至2011年上海市医院实验室常规化学项目飞行检查结果,为上海市医疗机构检验结果互认工作提供依据。方法收集2010至2011年上海市二级甲等以上医院实验室参加由上海市临床检验中心组织的2次飞行检查常规化学项目结果,计算实验室的合格率,并分别比较20个常规化学项目的全部参加实验室、三级医院、二级甲等医院和通过认可实验室检测结果间的离散度,用基于允许误差和生物学变异的分析变异质量标准评价每个项目的达标情况。结果上海二级甲等以上医院实验室间离散度分析,电解质[钾(K)、钠(Na)、氯(Cl)]3项和尿酸(UA)<3.0%,且Na≤1.6%;白蛋白(Alb)、钙(Ca)、肌酐(Cr)、总胆固醇(TC)、葡萄糖(Glu)、总蛋白(TP)均<5.0%;磷(P)、甘油三酯(TG)、尿素(Urea)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)≤7.9%;天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和总胆红素(TBil)离散度≤11.4%;高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)最大,术17.9%。认可实验室的Alb、ALT、AST、Ca、TC、TG、TP和CK检测质量相对优于其他组;全部医院、二级甲等医院、三级医院和认可实验室组间的均值基本无差异。ALT、CK和TG是20项常规化学检测中可达到较高质量标准的项目;其次为AST、K、TBil、UA和Urea;然后为Alb、Ca、Cr、Glu、P、TC和TP;Na、Cl、HDL-C、LDH和GGT为达到最低质量标准的项目。结论通过开展实验室全面质量管理,建立检测项目参考体系,开展中国人群基础数据研究,加强质控管理,以此为基础,逐步达到检测结果的互认,为临床提供可靠的诊疗依据。     

临床生化试剂盒质量评估方法

当前市售出现了许多生化试剂盒,如何判断其质量优劣成为保证检验质量的首要问题。本文根据作者多年来研制,鉴定和使用临床生化试剂盒的经验,从试剂盒的线性测定范围、准确度、精密度,干扰物试验、稳定性五个方面介绍生化试剂盒的评估法。     

蛋白质芯片技术筛选膀胱癌尿液标记物的研究

目的　寻找膀胱癌尿液中新的肿瘤标记物。　方法　采用表面增强激光解吸 /离子化 飞行时间质谱 (SELDI TOF MS)技术 ,选用IMAC Cu 3蛋白质芯片对 6 1例膀胱癌及 95例对照组尿液标本进行检测以筛选膀胱癌患者尿液中差异表达蛋白质。　结果　两组尿液标本结果比较发现 ,膀胱癌差异表达明显的潜在标记物 4个 ,相对分子质量分别为 344 5、370 3、3896、5 932。其中 344 5蛋白质被鉴定为α defensin ,诊断膀胱癌的敏感性为 80 % ,特异性为 75 % ;370 3蛋白质诊断膀胱癌的敏感性为32 % ,特异性为 94 % ,阳性者中 97%为高级别浸润性膀胱癌 ;3896、5 932诊断敏感性分别为 78%、5 5 % ,特异性分别为 4 0 %、35 %。　结论　SELDI TOF MS蛋白质芯片技术是一种快速、简便易行、用量少和高通量分析方法 ,能直接筛选出膀胱癌患者尿液中相对特异的潜在标记物 ,具有较好的临床应用价值。     

凋亡调节蛋白的表达与K562／VCR多药耐药性的关系

目的探讨K562/VCR细胞中凋亡调节蛋白表达的变化与其多药耐药性(MDR)的关系。方法通过免疫细胞化学法和免疫印迹法(westernblot)对凋亡调节蛋白Bcl-2、Bcl-X     

臭牡丹黄酮类化合物通过调控CXCR4对A549转移能力的影响

目的:探讨臭牡丹黄酮类化合物通过调控CXCR4对A549转移能力的影响。方法:采用siRNA技术将A549细胞CXCR4基因沉默后,设立实验分组,为A549对照组、A549+臭牡丹黄酮组、A549-CXCR4沉默组、A549-CXCR4沉默+臭牡丹黄酮组。每组加入100ng/ml的SDF-1处理48h后,Transwell检测各组A549细胞侵袭能力,Western Blot法检测各组CXCR4、MMP-9蛋白表达情况。结果:与A549对照组相比,加入臭牡丹黄酮后A549其体外侵袭能力下降,沉默CXCR4后,A549细胞侵袭能力显著下降,差异均有统计学意义(P 0. 01);与A549对照组相比,A549+臭牡丹黄酮组能降低CXCR4和MMP-9的表达,A549-CXCR4沉默组与A549-CXCR4沉默+臭牡丹黄酮组CXCR4和MMP-9的表达明显降低。结论:臭牡丹黄酮类化合物通过下调CXCR4表达,降低MMP-9蛋白表达,进而降低A549侵袭能力可能是其治疗肺癌的作用机制之一。