血清蛋白质谱模型的建立及在乳腺癌诊断中的应用

目的建立健康女性人群、乳腺癌患者血清蛋白质谱模型，并探讨对乳腺癌诊断的临床意义。方法应用表面加强激光解析电离化飞行时间质谱（SELDI—TOF—MS）技术，以弱阳离子交换芯片（CM10）结合血清蛋白质，分析60例乳腺癌患者、60例健康对照女性的血清样本，得到其蛋白质谱，用BioMarker Pattern软件分析蛋白质谱图，建立分类树模型并进行盲筛验证。结果乳腺癌患者与健康对照女性比较，筛选出12个差异蛋白质峰（P〈0．001），其中6个标志蛋白呈高表达，6个标志蛋白呈低表达。BioMarker Pattern软件在设定条件下自动选取3个标志蛋白用于建立乳腺癌诊断的分类树模型，此模型灵敏度为91.90％，特异度为81．25％。结论利用SELDI—TOF—MS技术可筛选出乳腺癌患者和健康对照女性血清蛋白质谱存在的差异蛋白质峰，可作为乳腺癌检测、随访监测的指标。     

围手术期成分输血对食管癌患者CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞的影响

目的探讨围手术期成分输血对食管癌患者CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞的影响,为临床合理输血提供实验依据。方法收集2011年7月至2012年5月期间食管癌根治手术患者50例,按围手术期输血与否及输血成分分为A、B、C、D、E 5组,每组10例:A组围手术期不输血,B组围手术期输入异体滤白悬浮红细胞,C组围手术期输异体悬浮红细胞,D组围手术期输异体滤白新鲜冰冻血浆,E组围手术期输异体新鲜冰冻血浆,另选10例健康人作为对照。分别于手术前、术后2、5、10d外周静脉采血。采用鼠抗人单克隆抗体CD4-FITC/CD25-PECy5/CD127-PE标记Treg细胞,经流式细胞仪检测,Treg细胞比例以CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞/CD4+T百分率表示。结果 A、B、D组术后2dTreg细胞比例开始增加,至术后5～10d恢复到术前水平。C、E组术后2dTreg细胞比例增加,至术后10d仍未恢复正常,且C、E组术后各时间段Treg细胞比例均分别高于B和D组(P<0.05)。结论围手术期滤白细胞输血对食管癌患者术后免疫功能无显著影响,输非滤白成分血可造成一定程度的免疫抑制。     

细胞因子诱导激活的杀伤细胞联合化疗治疗晚期结直肠癌的临床观察

 目的 评价细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）联合化疗治疗晚期大肠癌的临床疗效。方法 取外周血50 ml,分离单个核细胞,体外经IL-2、IFN-γ、抗CD3单抗、IL-1刺激培养8天后获得CIK细胞。CIK联合化疗组、行单纯化疗的同期配对晚期大肠癌组患者各50例,比较近期疗效及生存率,流式细胞术检测回输CIK前后患者免疫学指标,并观察其生活质量改善情况及不良反应。结果 CIK细胞治疗前患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+和NK细胞比例分别为54.779±14.228%、30.821±11.554%、16.676±6.256%、18.705±9.347%,治疗后分别为65.236±14.901%、37.292±8.880%、25.229±6.711%、22.950±8.9323%,较治疗前均显著提高(P<0.05);CIK联合化疗组患者生活质量明显改善,不良反应轻微;CIK联合化疗组的疾病控制率(DCR)率为64%（32/50）高于单纯化疗组的40%（20/50）(P<0.05),CIK联合化疗组与单纯化疗组生存率差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 CIK联合化疗可增强晚期大肠癌患者免疫功能,提高患者生活质量,有较好的临床疗效。     

CD4^＋CD25^＋T淋巴细胞对免疫细胞的调节

1995年Sakaguchi等首次报道了CD4 CD25 T淋巴细胞是一类具有免疫调节作用的细胞群.近年来关于T-reg 的研究方兴未艾, 对其抑制性机制和临床意义的认识在逐步深入.这类细胞可能是机体以"主动"方式来维持自身稳定的主要途径,具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特征,对于维持机体免疫稳定、阻止自身免疫反应、移植物耐受、肿瘤免疫、过敏反应及微生物感染方面都有一定作用.     

单倍体相合细胞移植引发GVHD和GVT时细胞因子变化的研究

研究表明,细胞因子在移植物抗宿主病(Graft versus host disease,GVHD)的发生、发展、防治及保存移植物抗肿瘤（Ggraft versustumor,GVT）效应中起越来越重要的作用.     

不同方式负载AFP抗原的DC诱导抗肝癌HepG2细胞免疫效应的比较

目的：比较AFP抗原以不同方式负载DCs对后者生物学功能的影响及体外刺激CTL对肝癌HepG2细胞的杀伤作用。方法：分离健康供者外周血单个核细胞培养DC,分别用（A）人工合成AFP抗原肽、（B）HepG2细胞裂解物、（C）HepG2细胞分泌的外泌体（tumor exosome, T-exo）、（D）AFP抗原的重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus expressing α-fetoprotein antigen, rAAV/AFP）致敏DC前体细胞及（E）未负载抗原的DC作为对照,经GM-CSF、IL-4及LPS联合诱导DCs分化成熟。流式细胞术检测rAAV/AFP病毒感染效率、各组DCs表型及其剌激初始T细胞的增殖效应,7-ADD/CFSE双染法流式细胞术检测各组DCs诱导CTL对AFP阳性HepG2细胞的杀伤作用。结果：几种抗原负载方式均可诱导DCs成熟、促进CTL增殖及特异性识别并杀伤HepG2细胞,但rAAV/AFP感染DCs后,其CD83、CD86、ICAM-1、CD58、CD40分子表达水平明显高于对照组（P<0.05）,rAAV/AFP+DC组和HepG2-Texo+DC组对HepG2细胞的杀伤作用均分别显著优于其他抗原负载（AFP/peptide+DC、HepG2 lysate+DC）组\[（44.92±4.12）% vs（28.42±3.29）%、（24.28±1.79)%;（41.40±2.87）% vs （28.42±3.29）%、（24.28±1.79）%;均P<0.05）\]。结论：rAAV/AFP高效感染DCs后能有效刺激初始T细胞增殖,并增强CTL对AFP阳性靶细胞的杀伤活性,而负载Texo的DCs也能诱导显著的抗肝癌效应,上述结果为基于DCs的肝癌疫苗的研发提供新的思路。     

精氨酸酶1在肝细胞癌中的表达及其临床病理意义

目的 检测人类精氨酸酶1(ARG1)在肝细胞癌(HCC)中的表达,分析其与患者临床病理特征的关系.方法 利用高通量组织芯片技术和免疫组织化学方法评价167例HCC及癌旁肝组织中ARG1蛋白的表达情况,采用x2检验和Spearman秩相关分析ARG1蛋白表达与各临床病理特征间的关系.应用实时荧光定量PCR方法检测68例HCC及其癌旁肝组织中的ARG1 mRNA表达水平.结果 HCC中ARG1蛋白表达水平为3.540±3.702,明显低于癌旁肝组织(10.290±2.303;t=-22.421,P=0.000).ARG1表达与HCC分化程度、组织学分级、微血管侵犯、术前甲胎蛋白水平、术后复发有关(P值均＜0.05).68例HCC组织中ARG1 mRNA表达水平为0.0997(0.213),低于癌旁肝组织0.563(0.459);u=-6.544,P=0.000].结论 ARG1在HCC中低表达,其可能参与HCC发生发展.检测ARG1表达可能有助于HCC辅助诊断、评估分化程度及预后判断.     

CARMA3基因敲减对结肠癌细胞HCT116生长和侵袭转移的抑制

目的:探讨CARMA3基因在人结肠癌细胞HCT116生长和侵袭转移中的作用及其机制。方法:选取高表达CARMA3的人结肠癌细胞株。应用慢病毒技术敲减CARMA3基因,puromycin筛选后构建稳定转染的HCT116-sh CARMA3细胞株。Real-time PCR和Western blot鉴定mRNA和蛋白表达的抑制情况。WST-1法和RTCA S16系统分析细胞增殖情况。集落形成实验观察集落形成。流式细胞术检测细胞周期。显微镜下观察上皮-间充质转化(EMT)形态变化。划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移与侵袭能力的改变。Western blot分析相关分子变化,探讨可能机制。结果:4株人结肠癌细胞株中HCT116细胞的CARMA3 mRNA和蛋白表达量最高,构建稳定沉默CARMA3的HCT116-sh CARMA3细胞株,其中HCT116-sh CARMA3-93细胞中CARMA3的mRNA和蛋白受抑制最明显,将其作为细胞模型。相比于对照组,HCT116-sh CARMA3-93细胞形态发生EMT逆转,其增殖、集落形成、迁移和侵袭能力明显下降(P0.01)。HCT116-sh CARMA3-93的G_0/G_1细胞所占比例明显升高,S期细胞比例相应下降(P0.05)。信号通路分子Bcl10和NF-κB表达明显下调,MALT-1变化不明显;细胞周期相关蛋白cyclin D1显著下调,cyclin A表达略有下降;侵袭转移相关分子MMP-2和MMP-9的表达下调,MMP-7未见改变,TIMP-1和TIMP-2的表达上调;EMT相关分子E-cadherin的表达水平升高,N-cadherin、Snail、Slug和Twist的表达水平呈不同程度降低。结论:CARMA3可通过改变细胞周期和侵袭转移分子的表达、调控EMT来影响结肠癌细胞HCT116的生长和侵袭转移。这可能与NF-κB信号通路发生改变有关。     

IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-17A在肝癌组织中表达及其与乙肝病毒感染的关系

目的:研究Th17(IL-17A)在肝细胞癌发生发展中的作用,尤其与乙肝病毒感染的关系。方法:收集39例原发性肝细胞癌患者的癌与非癌组织,应用流式细胞微球阵列术(CBA)检测IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-17A细胞因子水平,并与患者临床资料进行统计比较分析。结果:肝癌组织中IL-2、IL-4、IFN-γ表达水平好[分别为(4.61±0.28)、(3.37±0.58)、(3.08±1.08)pg/ml]显著低于非癌组织[分别为(5.57±0.59)、(3.77±0.70)、(3.69±1.20)pg/ml],而IL-6、IL-17A水平[分别为(280.09±254.68)、(2.66±1.66)pg/ml]显著高于非癌组织[分别为(6.58±1.92)、(1.49±0.98)pg/ml],同时无论癌组织还是非癌组织,高乙肝病毒载量(>1 000 U/ml)的组织IL-17A的表达[(3.45±1.86)pg/ml]显著高于低病毒载量(<1 000U/ml)的组织[(1.97±1.16)pg/ml]。结论:Th17细胞分泌的细胞因子IL-17A在肝癌组织中高表达,IL-2、IL-4和IFN-γ可能抑制其表达,而IL-6可能促进其表达;乙肝病毒感染有可能促进Th17的表达,从而降低患者的预后。     

纳米微粒偶联抗OX40/抗AFP抗体在细胞毒性T细胞抗肝癌中的作用

目的探讨乳酸-羧基乙酸共聚物(PLGA)制备的纳米微粒偶联抗OX40及抗AFP抗体(抗OX40/抗AFP-NP)对甲胎蛋白AFP158-166抗原肽特异性细胞毒性T细胞(CTL/AFP158-166)体外杀伤肝癌细胞的影响。方法用溶剂蒸发法制备纳米微粒(NP),并与抗OX40和抗AFP共价偶联。用扫描电镜观察所制得PLGA-NP纳米颗粒的形态;ZetaPlusTM粒度测定仪检测纳米微粒的粒径及电荷;用BCA蛋白定量方法检测纳米微粒偶联抗体的效率;用人外周血单核细胞诱导形成树突状细胞(DC),用AFP158-166抗原肽负载DC诱导AFP特异性的CTL/AFP158-166;分别用2-(4-碘苯)-3-(4硝基苯)-5-(2,4-磺苯基四氮唑)-2H-四唑单钠盐-1法(WST-1)法、ELISA及乳酸脱氢酶(LDH)法分别检测抗OX40/抗AFP-NP对CTL/AFP158-166细胞增殖能力、分泌IL-2和IFN-γ及杀瘤活性的影响。结果所制得的PLGA-NP为圆形,大小较均一,粒径约为(300±42)nm,带负电荷,约为-(25.12±5.34)mV。蛋白定量显示每mg的PLGA-NP偶联约100μg抗体,偶联效率为25%;增殖和活化实验显示偶联有抗OX40的纳米微粒能显著刺激CTL的增殖、IL-2和IFN-γ的分泌;杀伤实验显示,抗OX40/抗AFP-NP能显著增强AFP特异性CTL/AFP158-166细胞对HepG2细胞特异性杀伤作用,而对SMMC-7721杀伤作用无明显效果。结论抗OX40/抗AFP-NP能刺激CTL/AFP158-166细胞的增殖、细胞因子的分泌并增强CTL/AFP158-166细胞对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用。