单倍体相合细胞移植诱发小鼠移植物抗肿瘤效应的分析

目的:异基因造血干细胞移植是治疗恶性肿瘤的一种有效方法,但在异基因造血干细胞移植时,如何在减轻移植物抗宿主病的同时保留并加强移植物抗肿瘤效应是目前临床面临的一大课题.观察输注经与未经60Co照射的单倍体相合细胞治疗CB6F1小鼠肝癌模型中移植物抗宿主病临床表现,探讨输注经照射单倍体相合细胞在治疗实体增中减轻移植物抗宿主病的作用.方法:实验于2006-0312007-03在福建省肿瘤医院肿瘤免疫学研究室和福建省疾病预防控制中心动物房完成.①实验材料:来源于BABL/C小鼠的肝癌H22细胞株由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供.SPF近交系小鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:以皮下接种肝癌细胞(H22)的CB6Fl(BABL/C×C57BL/6杂交鼠,简称F1)雌性小鼠为受体鼠,经环磷酰胺腹腔化疗后,取C57BL/6小鼠的新鲜骨髓及脾脏细胞作为供体细胞,供体细胞分为经60Co照射和未经60Co照射.将F1小鼠随机分为3组:单纯化疗组、化疗 未经60Co照射细胞组、化疗 经60Co照射细胞组.观察3组小鼠移植物抗宿主病表现,并给予临床评分.⑨实验评估:于移植后第17天取小鼠皮肤、肠、肝、脾组织制备病理切片,观察移植物抗宿主病病理学改变所反应的情况,并检测小鼠瘤重和抑瘤率.结果:①化疗 经60Co照射细胞组小鼠移植物抗宿主病的临床表现明显轻于化疗 未经60Co照射细胞组(P＜0.05).②化疗 经60Co照射细胞组小鼠的皮肤、肠、肝、脾组织移植物抗宿主病的细胞病理学改变轻于化疗 未经60Co照射细胞组.③单纯化疗组与化疗 未经60Co照射细胞组、化疗 经60Co照射细胞组瘤重比较差异显著[(1.34±0.45)g,(0.6±0.38)g,(0.28±0.15)g,P＜0.05].化疗 未经60Co照射细胞组抑瘤率为55.22%,化疗 经60Co照射细胞组抑瘤率为79.22%.结论:供体细胞经7.5Gy 60Co照射的单倍体相合移植能诱发荷H22实体瘤小鼠产生移植物抗肿瘤效应,同时降低移植物抗宿主病的程度.     

细胞因子组合体外扩增人NK细胞的研究

目的：探讨细胞因子IL-2、IL-12、IL-15和IL-18组合对体外扩增人外周血来源的NK细胞受体表达及杀伤肿瘤细胞能力。方法：NK细胞的培养分为cIK组、IL2＋II,15组和IL-2＋IL-12＋IL-15＋IL-18组;流式细胞术检测培养的细胞表型及NK细胞受体表达;LDH法检测不同效靶比NK细胞对不同肿瘤细胞株的杀伤作用。结果：外周血淋巴细胞经细胞因子IL-2＋IL广12＋IL-15＋IL-18组合作用下,17d后NK细胞（CD3-CD56＋）比例上升至80％以上,NK细胞数扩增〉1000倍,明显高于其他两组,F=37．154,P〈0．001。NK细胞活化标志CD69。‘分子增加（t-21．271,P〈0．001）,NK细胞活化性受体（NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46）均有不同程度上调（P值均〈0．05）,而NK细胞抑制性受体CDl58b（t=3．416,P=0．021）和CDl59a（t=4．209,P=0．018）不同程度下调,T淋巴细胞、B淋巴细胞（CD19＋）、单核巨噬细胞（CD14＋）、调节性T细胞（T—reg）等均显著减少,P〈0．001。对扩增的NK细胞杀伤敏感的肿瘤细胞株均高表达MHCI类相关蛋白A（majorhistocompatibility complexclass Ichainrelated moleculesA,MICA）,MICA表达分别为K562（46．2±3．2）％、MCF-7（56．5±4．7）％、HTC-8（52．5±4．1）％和Eca-109（36．5±2．5）％,而对NK细胞抵抗的细胞株均低表达或不表达MICA分子,分别为Raji0、MDA-MB-435s0和HT-29（1．2±0．8）％。结论：细胞因子IL-2＋IL-12＋IL-15＋IL-18组合能有效的扩增外周血来源NK细胞,上调其活化性受体,下调抑制性受体,其数量及功能均满足临床治疗需要。     

肝癌切除肝缺血再灌注损伤前后的蛋白质组学变化

背景：肝癌切除肝缺血再灌注损伤可促进微小转移灶的侵袭转移并引起线粒体损伤。目的：比较肝癌切除手术过程中肝正常组织缺血再灌注损伤前后蛋白质表达谱的改变,筛查发生肝缺血再灌注损伤应激的相关蛋白质分子标志物并探讨可能机制。方法：应用双向等电聚焦/聚丙烯酰胺凝胶电泳建立20例肝癌切除患者肝缺血再灌注前与灌注后15min肝正常组织的全细胞蛋白质和线粒体蛋白质表达图谱,并进行差异分析,应用基质辅助激光解吸离子化串联时间质谱对差异蛋白质点进行鉴定,并进行生物信息学分析。结果与结论：相同条件下对各组全细胞和线粒体蛋白样品分别进行3次双向电泳,筛选在3次电泳中均存在的差异点进行分析,在全细胞蛋白质图谱中共鉴定出5个差异蛋白,在线粒体蛋白质图谱中未鉴定出明显的差异蛋白。结果可见肝癌切除手术过程中肝缺血再灌注15min即可使细胞骨架蛋白、热休克蛋白等细胞保护蛋白表达发生改变,同时有促进肿瘤转移的风险,需要采取预防措施降低影响,但线粒体蛋白表达基本未发生改变。     

食管癌中MICA的表达及其意义

  目的  观察食管癌细胞株组织膜MHCⅠ链相关分子A(MHC class Ⅰ chain-related gene A, MICA)及血清中可溶性MICA表达, 探讨食管癌中MICA的表达及其临床意义。  方法  流式细胞术检测膜型MICA(mMICA)及NK细胞表面NKG2D表达, ELISA方法检测乳腺肿瘤患者外周血可溶性MICA(sMICA)的分泌。分组实验分析可溶性MICA(sMICA)对NKG2D表达的影响。  结果  食管细胞膜型MICA在食管癌旁组织无表达, 在31.7%食管癌组织有表达, 表达量为(42.2±3.6)%。可溶性MICA含量在健康成年者为阴性, 食管癌患者中74.67%阳性, 含量为(1977.30±292.67)ng/L。食管癌患者中血清sMICA含量高低与TNM分期呈正相关, 远处转移组比无远处转移组高(P < 0.05), 但和病理类型表达无差异。含可溶性M!CA的血清可明显下调NK细胞NKG2D的表达, 从而降低NK细胞对食管癌细胞株ECA-109的杀伤活性。  结论  食管癌细胞膜表达MICA, 可作为食管肿瘤相关性抗原。而可溶性MICA含量高低与TNM分期呈正相关, 可通过下调NK细胞NKG2D表达介导肿瘤免疫逃逸。      

乙型肝炎病毒X蛋白通过DNMT3A诱导肝癌细胞RUNX3基因高甲基化

目的研究肝癌细胞中乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对抑癌基因Runt相关转录因子3(RUNX3)表达的影响及相关作用机制,探讨乙肝病毒促肝癌发生的表观遗传调控。方法HBx重组表达载体转染5-aza-CdR处理或未处理的Huh7、HepG2肝癌细胞,Western Blot及RT-qPCR检测RUNX3 的表达,分析RUNX3基因启动子CpG岛甲基化水平。合成DNA甲基转移酶3A的小干扰RNA(siRNA_3A)单独转染或与HBx共转染,检测RUNX3的表达。PCR检测21例手术切除的肝细胞癌新鲜组织标本HBx表达情况,比较HBx阴性与HBx阳性组织样本间RUNX3的表达差异以及启动子甲基化程度。结果过表达HBx可导致肝癌细胞内RUNX3表达下调,且甲基转移酶抑制剂5-aza-CdR可完全阻断HBx对RUNX3的抑制作用。HBx诱导RUNX3基因启动子CpG岛发生高甲基化,但不影响DNA甲基转移酶的表达。siRNA_3A转染肝癌细胞后,RUNX3 mRNA与蛋白表达均显著上调;其与HBx共转染后,逆转了单独HBx对RUNX3的抑制作用。HBx阳性的肝癌组织中RUNX3 mRNA表达水平较HBx阴性组低,且RUNX3启动子甲基化程度也相对较高。结论HBx通过促进RUNX3启动子区域发生高甲基化而抑制其表达,且这一过程是由DNMT3A所介导的。     

血清Cyfra21-1和SELDI技术联合检测肺鳞癌的临床意义

目的探讨血清Cyfra21-1和SELDI技术联合应用在肺鳞癌患者中的诊断意义。方法应用电化学发光技术对59例病理确诊肺鳞癌患者和60例健康对照者血清进行Cyfra21-1检测, 同时应用SELDI-TOF-MS和CM10芯片检测该血清,分析两种手段的联合诊断价值。结果电化学发光法单项检测Cyfra21-1的敏感度为77.966%、特异性为96.667%。应用SELDI技术以及肺鳞癌诊断模型进行分析,敏感度为83.051%、特异性为65.385%。而联合检测的敏感度为 94.915%、特异性为95.000%。结论与单用电化学发光法检测Cyfra21-1相比,联合SELDI技术检测更能提高肺鳞癌诊断的敏感度。联合检测的特异性也比单独使用SELDI技术有明显提高。     

输注经照射的HLA部分相合的异基因单个核细胞治疗晚期肾细胞癌

背景与目的：肾细胞癌是一种对免疫治疗敏感的肿瘤,包括了非清髓性异基因移植。然而由于严重的毒性,许多转移性肾细胞癌并不适合非清髓性异基因移植。这促使了其他一些新的异基因免疫治疗的发展。本研究评价输注经照射的HLA部分相合的异基因单个核细胞治疗晚期肾细胞癌的有效性和安全性。方法：选择经病理证实的晚期肾细胞癌患者,予输注经照射的HLA部分相合的异基因单个核细胞。每2个月输注1次,治疗有效或稳定者继续输注,直至疾病进展或出现不能耐受的不良反应或患者（或供者）拒绝继续使用。结果：8例患者进入本研究。6例患者每次输注后每日口服沙利度胺100mg至300mg两个月,1例达到持久的完全缓解（CR）,5例稳定（SD）,2例进展（PD）。8例患者的中位疾病无进展时间为292d,中位生存时间为879d以上。毒性反应轻微。结论：输注经照射的HLA部分相合的异基因单个核细胞治疗晚期肾细胞癌有了一定疗效,值得进一步研究。     

乳腺癌患者血清HER2的检测及其临床意义

目的：探讨乳腺癌患者血清HER2水平与组织HER2水平和临床病理特征的关系,分析其对患者治疗药物选择和预后预测的意义。方法：选择福建省肿瘤医院2008年1月至10月经病理证实的乳腺癌患者67例,乳腺良性肿瘤患者20例,另选择体检健康女性20例。应用免疫组织化学方法检测乳腺癌组织HER2的表达,ELISA法检测血清HER2的表达水平。结果：乳腺癌患者血清HER2水平及阳性率均高于健康女性及乳腺良性肿瘤患者（P<0.05）;组织HER2阳性乳腺癌患者血清HER2水平及阳性率均高于组织HER2阴性乳腺癌患者（P<0.05）,且血清HER2阳性率与组织HER2表达状态正相关,血清学检测方法与组织学检测方法一致性较好;部分组织HER2阴性乳腺癌发生复发转移后血清HER2增高,复发转移性Ⅳ期患者血清HER2阳性率高于Ⅰ〖DK〗～Ⅲ期患者（P<0.05）。结论：乳腺癌患者中血清HER2水平增高,其阳性率与组织HER2表达状态及临床分期相关,该检测对乳腺癌的诊断、评价HER2状态及判断预后有一定意义。     

GKN2在胃癌细胞增殖、转移中的作用及机制

目的探讨胃动蛋白2(gastrokine 2, GKN2)对胃癌细胞的生长增殖、侵袭、转移的影响及分子机制。方法利用qRT-pCR和Western blot法检测GKN2在胃癌组织中的表达;构建对照细胞株AGS-CON、SGC-7901-CON与GKN2过表达细胞株AGS-GKN2、SGC-7901-GKN2,应用qRT-pCR和Western blot法检测GKN2在各细胞株中的表达变化,RTCA系统和克隆形成实验检测细胞增殖功能,Transwell及划痕实验检测细胞迁移和侵袭功能,并通过Western blot观察GKN2表达变化对PI3K/AKT/PTEN/mTOR信号通路相关蛋白的作用。结果 GKN2在胃癌组织及多株胃癌细胞株中的表达明显低于癌旁组织和正常胃上皮细胞;RTCA系统显示GKN2过表达组的增殖活性明显低于对照组;克隆形成实验结果显示,GKN2过表达组的细胞克隆数和大小明显低于对照组;Transwell及划痕实验结果表明,GKN2过表达组纵向迁移/侵袭数和横向迁移数明显低于对照组。Western blot结果显示,GKN2过表达下调增殖相关蛋白PCNA、Survivin,抗凋亡蛋白BCL-2及转移相关蛋白MMP-7、MMP-9和MMP-2表达水平,而上调Timp2表达水平。Western blot结果亦显示,GKN2影响PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路的激活水平,特别是明显上调PTEN的表达。结论 GKN2在胃癌组织及多株胃癌细胞株中呈低表达或表达丢失。GKN2影响胃癌细胞的增殖和转移,可能通过PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路促进胃癌的发生、发展。     

谷胱甘肽及其相关酶系统与肿瘤多药耐药的关系

谷胱甘肽 ( GSH)及其相关酶是人体重要的解毒酶。本世纪五十年代发现细胞内 GSH含量的减低能够增加癌症病人对电离辐射的敏感性 ,在七十年代末观察到 GSH含量的增加与对 DNA损伤性药物的耐药关系 ,后来许多体内外实验研究表明 GSH及其相关酶与烷化剂耐药有关。谷胱甘肽硫转移酶( GSTs)是由五类基因编码的超基因家族 ,包括四类胞液同功酶π、μ、θ、α和一类膜结合微粒体 ,不同胞液同功酶之间有 40 %的同源性[1] 。膜结合微粒体主要存在于肝内质网 ,与胞液同功酶没有明显的同源性 [2 ] 。 GSTs能够催化还原型 GSH分子中的巯基攻击…