日本血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基全长cDNA的克隆与功能分析

目的对用表达序列标签(EST)策略从日本血吸虫(Schistosomajaponicum)尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行全长cDNA克隆及功能预测。方法将插入于pTriplEx2 质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTn程序搜索,发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit, eIF2α) 基因高度同源。根据该EST序列设计与pTriplEx2 质粒上的5'端测序引物相匹配的PCR下游引物,从该cDNA文库中扩出包含eIF2α全长ORF的cDNA片段。将PCR产物纯化后克隆到pGEM-T载体上,并对此克隆进行测序得到其全长cDNA序列。用NCBI 站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索;用blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较。同时用网上分析软件进行基序和保守区域的搜索。结果发现一个与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源的日本血吸虫新基因,核苷酸与氨基酸水平的同一性分别为87%和79%,编码由327个氨基酸组成的蛋白序列。结论用EST策略筛选到一个日本血吸虫新基因,编码eIF2α亚基,全长编码序列与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源。     

荧光内参在校正Caspase-3/7活性检测偏差中的应用

目的 改进Caspase-3/7活性检测方法.方法 在顺铂诱导的HeLa细胞凋亡模型中,分别利用传统的和改良的实验方法检测Caspase-3/7的活性变化,并与Western印迹实验结果进行方法学比较.结果 改良的实验方法显示不同剂量顺铂诱导下,HeLa细胞Caspase-3/7活性有剂量依赖性增高,与Western印迹实验结果相一致,但传统实验方法显示HeLa细胞Caspase-3/7活性呈现先增高后降低的趋势.结论 由于参测细胞数不同,导致这种Caspase-3/7活性检测方法不能真实反映细胞凋亡程度.本研究成功建立了一种新的改良型Caspase-3/7活性检测方式,这种检测方法可以排除不同凋亡诱导方式诱导细胞凋亡时所产生的因参测细胞数不同所造成的Caspase-3/7活性检测的误差.     

日本血吸虫新基因——腺苷酸激酶基因的发现与克隆

目的将用表达序列标签(expression sequence tag, EST)策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因——腺苷酸激酶(adenylate kinase,AK)cDNA克隆到表达质粒pET32a(+)上,为下一步研究该基因的功能做准备。方法将插入于pTriplEx2 质粒上的cDNA进行测序,用BLASTn程序搜索测序结果,根据表达质粒pET32a(+)上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物,将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上,将重组T载体经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后切下的SjAK基因导入原核可溶性表达质粒pET32a(+)中。结果本研究所发现的新基因与曼氏血吸虫AK基因的同一性达86%,PCR产物的片段长度与预期大小一致,重组T载体及表达质粒经EcoR I及XhoI双酶切后证明具有与目标片段长度相符的插入片段。结论发现日本血吸虫的cDNA与曼氏血吸虫AK cDNA高度同源,并且成功地构建出重组表达质粒pET32a(+)-SjAK。     

大鼠肾间质纤维化中微小RNA-21的表达变化及其机制

肾间质纤维化是许多肾脏疾病的重要病理变化,转化生长因子β(TGF-β)信号通路的活化是纤维化发生的重要标志,抑制TGF-β信号通路可以明显缓解肾间质纤维化[1].微小RNA(miRNA)是一组含21～25个核苷酸的非编码RNA,通过转录后调节机制参与机体各个器官的生物学功能,在细胞存活、增殖、分化、凋亡、炎性反应、纤维化等信号通路中扮演重要角色[2].     

血清学阴性的乙肝相关性肾炎8例分析

目的:通过对血清学阴性的乙肝相关性肾炎8例的临床和病理的分析,探讨血清学阴性乙肝相关性肾炎的特点,以期提高诊治水平.方法:分析我科自2008年1月~2010年12月收治的8例血清学阴性乙肝相关性肾炎患者的临床、病理、治疗情况.结果:8例患者病理表现均为不典型膜性肾病,增加行HBsAg免疫荧光检查均提示HBsAg(++)沿肾小球毛细血管袢分布,查乙肝五项、HBV-DNA均阴性,肝功能正常,7例肾功正常患者均使用中等量强的松(40mg/d)+来氟米特治疗(最初3d给予负荷剂量50mg/d,之后给予维持剂量20mg/d),12周后4例完全缓解,2例部分缓解,强的松规律减量后未复发,2例肾功能异常者先给予甲基强的松龙冲击治疗(500mg/d,共3d)后再予强的松40mg/d联合来氟米特治疗,所有患者均使用ACEI、保肝药物、潘生丁等综合治疗,每月监测血清HBV-DNA均阴性,每周监测肝功能正常,未使用抗病毒治疗.结论:血清学阴性乙肝相关性肾炎患者病理表现多为不典型膜性肾病,中老年人不典型膜性肾病即使乙肝血清学阴性也应排除乙肝相关性肾炎可能,对肝功正常,HBV-DNA阴性者使用中等量强的松联合来氟米特治疗缓解率高,同时联合保肝治疗,肝功能无明显变化,安全性良好.     

骨髓间充质干细胞移植对急性肺水肿大鼠肺组织的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSC）移植对急性肺水肿大鼠肺组织影响。方法80只大鼠随机分为肺水肿组、治疗组、预防组、空白对照组、对照组。腹腔注射氯化铵建立模型,预防组及治疗组分别于模型建立前后移植4,6-二乙酰基．2．苯基吲哚标记的MSC,移植后不同时间点（30min,2h,1d,7d）计算肺重系数、测定血清肿瘤坏死因子α（TNF—α）含量,观察肺脏结构,检测MSC定植及广谱细胞角蛋白（PCK）表达。结果治疗组2h时肺重系数显著降低（P〈0．05）。肺水肿组及预防组TNF—α含量30min时最高,治疗组TNF-α明显低于肺水肿组（P〈0．01）。2h时肺水肿组及预防组肺水肿病变明显,而治疗组肺水肿病变减轻。治疗组1d时肺组织有植入细胞,7d时支气管壁出现少量植入细胞同时表达PCK。结论MSC治疗性移植可减轻肺水肿,而预防性移植无法减轻肺水肿。     

环氧合酶2 mRNA 3’UTR荧光素酶报告基因载体的构建

目的:通过构建环氧合酶2(COX2)mRNA 3’UTR的全长及其截短体荧光素酶报告基因载体,为研究COX2基因在炎症条件下的的转录后调控提供有效的工具。方法:通过从胃癌细胞SGC-7901提取RNA,反转录成cDNA后,以此为模板,PCR扩增COX2 3’非翻译区(3’-UTR)全长及截短的序列,并将该序列连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-control,构建pGL3-COX2 3’UTR全长及pGL3-COX23’UTR不同截短体。测序后将上述载体分别与pRL-TK载体共转染293-T细胞,48 h后裂解细胞检测荧光素酶的活性。最后通过ELISA检测在IL-1β的刺激下COX2的下游产物PGE2的表达,并再次测定pGL3-COX2 3’UTR全长的荧光素酶活性。结果:成功构建了pGL3-COX2 3’UTR全长及pGL3-COX23’UTR不同截短体,荧光素酶报告系统表明COX2 3’UTR对基因表达具有较强的调控作用。而在炎症因子IL-1β的刺激下,pGL3-COX2 3’UTR全长荧光素酶的活性明显升高。结论:成功构建了COX2 mRNA 3’UTR荧光素酶报告基因载体并证明在IL-1β的刺激下COX2表达上调,参与转录后调控。     

维持性血液透析患者甲状腺功能减退症与贫血的临床相关性分析

目的 探讨维持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)患者甲状腺功能减退症(简称甲减)的发病情况,分析甲减与肾性贫血的相关性,探讨积极治疗甲减后肾性贫血的改善情况. 方法 对2005年7月至2012年7月在解放军第三二三医院透析中心接受MHD的患者甲状腺功能情况进行回顾性调查研究.使用Pearson's相关分析x2检验和Mann-Whitney U检验分析MHD患者甲减与临床特点的相关性,logistic回归分析用于贫血危险因素分析,配对t检验用于分析治疗甲减前后患者贫血状况的差异. 结果 所有274例透析患者中,19例(6.9％)有甲减,其中,男性发病率4.9％(7/142),女性发病率9.1％(12/132).非甲减患者的血红蛋白水平高于甲减患者(u=15.262,v=∞,P＜0.001).logisitic回归分析表明Kt/V、血清铁蛋白、甲功与患者贫血具有相关性.配对t检验(t=5.115,v=18,P＜0.0001)提示治疗甲减前后,患者血红蛋白含量有明显差异. 结论 MHD患者更容易并发甲减,而甲减与患者血红蛋白含量有相关性,积极治疗甲减,可能有助于改善患者的贫血状况.     

RNA 结合蛋白 QKI 吸附海绵载体的构建及其对肝癌细胞增殖的影响

目的：构建针对 RNA 结合蛋白 quaking (QKI)的特异性吸附海绵载体(QRE-sponge),验证其对肝癌细胞系 HepG2中内源性 QKI 分子的抑制作用。方法利用人源 QKI 的特异性识别效应原件(qua-king responsive element, QRE)序列,重复13个拷贝,串联克隆至 pEGFP-C2真核表达载体中,转染 HepG2肝癌细胞及293 T 细胞。通过 Real time PCR,双荧光素酶报告基因检测及 MTT 实验进一步验证该吸附海绵的效果及其对肝癌细胞系 HepG2增殖的影响。结果 pEGFP-C2-QRE-SP 载体经测序证实构建成功,可以成功的在 HepG2细胞中表达,其绿色荧光呈阳性,且转染24 h 后显著影响 HepG2细胞中 QKI 下游靶基因的表达(P ﹤0.05)。双荧光素酶报告基因系统显示, pGL3-QRE-SP 载体可以显著抑制外源性 QKI 的活性(P﹤0.05)。 MTT 结果显示 pEGFP-C2-QRE-SP 载体促进 HepG2细胞的增殖。结论 QKI 吸附海绵载体策略构建的 pEGFP-C2-QRE-SP 载体可以成功的诱骗吸附 QKI,并促进肝癌细胞系 HepG2增殖,为进一步研究 QKI的功能研究提供了良好工具。     

右旋糖酐氢氧化铁治疗尿毒症血透患者贫血疗效观察

肾性贫血对尿毒症患者的长期生存有着很大的影响，静脉铁在中国上市以前对于口服铁剂吸收不良，贫血难以纠正的患者无更好的应对方法。2002—01～2007—05我们对51例尿毒症长期维持性血透铁缺乏，口服铁治疗效果不佳的患者静脉使用低分子右旋糖酐氢氧化铁（科莫非）进行了疗效和安全性观察。报告如下。