分泌性HIV-1 Nef-EGFP融合蛋白表达载体的构建与鉴定

目的： 构建含有人类免疫缺陷病毒I型（human immunodeficiency virus type I,HIV-1）负性调节因子（negative regulation factor,Nef）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的重组融合蛋白分泌性表达载体,并检测该融合蛋白在真核细胞中的表达及其在培养上清中分泌情况,为进一步研究Nef功能奠定基础。方法： 利用PCR扩增出HIV-1 Nef和EGFP基因,插入到分泌性表达载体pSecTag2B中。构建的pSecTag2B-Nef-EGFP融合蛋白表达质粒,转染293T细胞,荧光显微镜下观测细胞中Nef-EGFP融合蛋白的表达。收集细胞及上清液,蛋白质印迹和ELISA法分别检测Nef-EGFP融合蛋白的表达及其分泌。结果： 限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列测定证实,成功构建了含有Nef-EGFP基因的分泌性表达载体,该质粒转染293T细胞后,蛋白质印迹法能够检测到Nef EGFP融合蛋白的表达条带,ELISA法检测上清液中目的蛋白分泌量为1.7 ng/ml。结论： 成功构建含有Nef-EGFP的融合蛋白表达质粒,融合蛋白Nef EGFP在293T细胞中获得表达,并能分泌到胞外。     

KSHV抗凋亡蛋白vFLIP编码基因的克隆表达及抗vFLIP多克隆抗体的制备与鉴定

目的： 制备由卡波济肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi′s sarcoma associated herpesvirus,KSHV）编码的病毒FLICE抑制蛋白（viral FLICE inhibitory protein,vFLIP）的多克隆抗体,通过vFLIP重组蛋白对该抗体特异性进行鉴定,并将此抗体初步应用于天然病毒vFLIP蛋白表达的检测。方法： 对vFLIP蛋白抗原表位进行预测分析,设计并合成3条多肽,将合成肽与载体蛋白钥孔戚血蓝素（KLH）偶联作为抗原,免疫新西兰白兔,制备抗vFLIP的多抗;以pCDH-vFLIP质粒为模板扩增vFLIP片段,插入到真核表达载体pEF-MCS-Flag-IRES/Puro中,构建pEF-vFLIP表达载体,利用脂质体将其转染HEK293T细胞,并在其中表达vFLIP。采用ELISA、蛋白质印迹法鉴定vFLIP多克隆抗体的效价及特异性,将该抗体用于天然病毒vFLIP的检测。结果： 经限制性内切酶鉴定和核酸序列测定证实成功构建了重组质粒pEF-vFLIP,Flag抗体可以特异性识别该质粒在HEK293T和EA.hy926细胞内表达的vFLIP-flag融合蛋白。进一步的ELISA结果显示,制备的兔抗vFLIP多克隆抗体效价为1∶11 000以上。该抗体不但与HEK293T和EA.hy926细胞内表达的重组vFLIP-flag融合蛋白反应,而且能够特异性识别PEL细胞中天然的病毒vFLIP蛋白。结论： 构建了含vFLIP基因的重组真核表达载体;采用人工合成肽作为半抗原制备的抗KSHV vFLIP多抗,可以成功地检测重组vFLIP蛋白和天然病毒蛋白。     

5-FC/CD∷UPRT联合基因对大鼠脑胶质瘤的治疗作用

目的探讨5-氟胞嘧啶(5-FC)/CD∷UPRT联合基因系统对大鼠脑胶质瘤的治疗作用。方法以逆转录病毒介导构建C6-CD∷UPRT细胞系,应用立体定向技术移植C6-CD∷UPRT细胞至SD大鼠尾状核,设立C6-pLXSN和C6细胞为对照组,建立脑胶质瘤荷瘤鼠模型,应用5-FC腹腔注射治疗,观察肿瘤大小、大鼠存活期、电镜观察细胞形态和流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡指标的变化。结果5-FC/CD∷UPRT治疗组(A组)与各对照组相比,A组肿瘤直径平均为(4.2±0.7)mm,远小于对照组的(8.3±1.3)mm,(P<0.01);对照组平均存活期(32±3)d,A组为(85±2)d(P<0.01);A组电镜显示核染色质分裂明显,并见典型的凋亡小体;A组肿瘤细胞中凋亡细胞所占百分率为19.36%。结论5-FC/CD∷UPRT联合基因对大鼠脑胶质瘤有显著的治疗效果。     

青少年预防艾滋病生活技能培训的实践与体会

延边皮肤病防治院承担延边地区艾滋病防治工作。为了有效遏制艾滋病蔓延和上升，切实提高青少年生活技能，加强学校艾滋病防治宣传教育工作，增强青少年自我保护意识，了解艾滋病防治知识，抵御不良行为的诱惑，结合我州实际，从2006年起在全州选择一些重点中学对学生进行生活技能培训和同伴教育活动，使中学生对艾滋病认知程度有了较大提高，高危行为明显降低。中学生艾滋病防治知识知晓率也得以显著提高。     

抗卡波济肉瘤相关疱疹病毒vIL-6蛋白合成肽多克隆抗体的制备及初步应用

目的制备与鉴定抗卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)病毒白细胞介素6(viral interleukin-6,v IL-6)多克隆抗体,并探讨将其初步应用于检测天然v IL-6蛋白的价值。方法设计并合成3条v IL-6候选肽,免疫新西兰兔,制备抗v IL-6多克隆抗体,用间接ELISA法鉴定该抗体的效价。构建重组质粒p HAGE-v IL-6并转染293T细胞和EA.hy926细胞,表达并纯化v IL-6-His融合蛋白,通过western blot鉴定抗v IL-6多克隆抗体对该蛋白质的识别。通过western blot和免疫荧光方法检测对KSHV阳性细胞中天然v IL-6蛋白的识别。结果由3号v IL-6候选合成肽制备的抗v IL-6多克隆抗体效价大于8 000,能特异性识别重组质粒p HAGE-v IL-6转染293T细胞和EA.hy926细胞产生的v IL-6-His融合蛋白,以及天然v IL-6蛋白。结论本实验采用合成肽作为半抗原制备的抗v IL-6多克隆抗体,可以应用于检测重组和天然v IL-6蛋白。     

CD2AP启动子的克隆和活性分析

目的 构建表达CD2AP基因转录起始位点上游启动子的表达质粒,转染人类胚胎肾(HEK)-293T细胞,评价其启动子活性.方法 以人全血细胞总DNA为模板,PCR扩增CD2AP转录起始位点上游2082 bp的启动子区片段.亚克隆此片段至无启动子活性的pGL-3基本载体荧光素酶报告基因上游的多克降位点,构建含CD2AP启动子的重组报告质粒.转染HEK-293T细胞,行荧光素酶活性检测,计算相对活性单位(RLU).生物信息学分析转录因子结合位点.结果 酶切,测序鉴定证实成功构建含有CD2AP基因转录起始位点上游2082 bp的启动区的表达质粒.CD2AP的启动子与正常的pGL-3基本质粒比较,其RLU增加了74.8倍.其上游启动子区序列中含多个转录因子结合序列如AP1、Sp1、CREB和GATA-1等.结论 CD2AP转录起始位点上游序列在HEK-293T细胞中具有较强的启动活性.     

人类疱疹病毒8型病毒干扰素调节因子编码基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的:分离、克隆人类疱疹病毒8型(HHV-8)编码的病毒干扰素调节因子(virusinterferonregulatoryfactor,vIRF)基因K9,并将其导入真核细胞中进行表达。方法:根据GenBank登记的K9基因核苷酸序列设计一对PCR引物,其5′端分别引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增K9基因,经双酶切后克隆进真核表达载体pcDNA3.1( )中,构建重组真核表达质粒pK9。为了便于蛋白检测,再设计第二对引物,上游引物不变,在下游引物5′端引入了Flag序列。以质粒pK9为模板再次PCR,扩增K9-Flag基因,并把K9-Flag序列克隆入pcDNA3.1( )中,得到重组质粒pK9F。重组质粒经酶切鉴定,核酸序列测定和分析后瞬时转染NIH3T3细胞,用RT-PCR、Westernblot分别从核酸和蛋白水平检测K9基因的表达情况。结果:PCR分离、克隆的K9-Flag序列全长1380bp,核酸序列分析显示克隆的K9基因与GenBank中己经登记的K9基因序列100%同源,引入的Flag序列完全正确;RT-PCR和Westernblot都在K9预期位置检测到特异性条带。结论:HHV-8K9基因在NIH3T3细胞中获得了正确表达。     

超声介导SonoVue微泡破裂促进报告基因在肝脏中表达的实验研究

目的:探讨超声介导SonoVue微泡破裂法促进外源基因在肝脏中表达的作用,评估其转染效率、安全性。方法:经SD大鼠门静脉置管输入SonoVue微泡建立动物模型,以虫荧光素酶基因为报告基因,观察不同浓度的微泡促进虫荧光素酶基因在肝脏中的表达强度与持续时间,实验结束后采下腔静脉血检测肝肾功能并取肝、肾组织常规HE染色行组织学检查。结果:随着微泡浓度的增加,虫荧光素酶基因表达逐渐增加,在微泡浓度为100%(V/V)时,转染效率最高,持续到21天仍有表达。转染前后的肝肾功能(AST、ALT、ALB、BUN、Cr)无明显变化,HE切片未发现肝肾组织结构的改变。结论:超声介导微泡破裂法能有效地促进外源基因在肝脏中的表达,为肝脏疾病的基因治疗提供了新的途径。     

卡波济肉瘤相关疱疹病毒包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体的鉴定

目的:对已制备并经初筛的卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体进行特异性鉴定。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA),经3次克隆选择,筛选出能稳定分泌针对K8.1蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株共9株。采用Westernblot法评价9株杂交瘤细胞培养上清识别原核表达重组K8.1蛋白和原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1中KSHVK8.1包膜糖蛋白的能力。结果:筛选了9株能够稳定分泌抗K8.1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;Westernblot法显示,9株单抗均能特异性识别原核表达K8.1/GST融合蛋白和BCBL-1中KSHVK8.1包膜糖蛋白。结论:成功制备了KSHV包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体。