医学分子生物学教学中培养批判性思维的探讨

在八年制医学分子生物学教学中,第四军医大学生物化学与分子生物学教研室尝试并探索批判性思维的培养,通过启发思考,鼓励提问,有"破"有 "立"和探讨趋势,从多个角度促进学生更为全面的发展.     

干细胞伦理之争的“终结者”——谈诺贝尔生理学与医学奖获得者山中伸弥

2012年诺贝尔生理学与医学奖得主日本学者山中伸弥在发现诱导多能干细胞(iPS)之前没有显赫的学术地位,但是他独特的思维方式,敢于挑战科学大问题的胆量,使他在最短时间内一跃成为生命领域的领跑者,开启了再生医学的全新篇章。探寻这位快速登上科学之巅的学者,回顾他的成长经历和伟大科学发现背后的故事,思维灵感会被点燃,创新之奥秘和乐趣也会渗透于心。     

活化T细胞核因子对组成性启动子SV40的调控作用

目的:利用双荧光素酶报告系统探讨活化T细胞核因子(NFAT)能否调控常见组成性启动子CMV,SV40和TK,为不同条件下选择合适双荧光报告系统内参提供依据。方法:用限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ分别从质粒pCDNA3.1和pRL-TK中切下CMV和TK启动子,克隆至pGL3-basic载体中,构建成pCMV-Luc和pTK-Luc载体。将构建pCMV-Luc和pTK-Luc以及商品化的pGL3-control(SV40启动子驱动),分别与SV40(pBIND)和TK(pRL-TK)两种启动子驱动的两种内参质粒共转染入HEK293细胞;观察过表达组成性活化NFAT后相对荧光素酶活性读数的改变。结果:成功构建了pCMV-Luc和pTK-Luc质粒,荧光素酶活性检测发现,常见组成性启动子SV40启动子对过表达组成性活化的NFAT存在一定的反应。结论:T细胞活化过程中重要的转录因子NFAT能够调控SV40启动子活性;表明常见组成性启动子SV40并非真正、绝对的组成性不变。因此,在荧光素酶报告系统内参选择时需要充分考虑该问题,本研究为合理选择内参质粒提供了一个可行策略。     

牛蒡苷元通过调节 MMP-2，MMP-9表达抑制增生性瘢痕的形成

目的：观察牛蒡苷元对增生性瘢痕(hypertrophic scar)形成的作用,并探讨其抑制增生性瘢痕形成的机制。方法新西兰大耳兔25只,将其分为对照组( A 组),模型组(B 组),牛蒡苷元治疗组(0.5 mg/ ml)(C 组),牛蒡苷元治疗组(2 mg/ ml)(D 组),牛蒡苷元治疗组(6 mg/ ml)(E 组),在兔耳腹侧面建立增生性瘢痕模型,术后按组别进行相应处理,观察创面愈合和瘢痕的增生情况。用药后在第6周取材,进行 HE 染色,天狼猩红染色和 Masson 染色,并用 Western 印迹检测 MMP-2, MMP-9表达情况。结果 HE 染色,天狼星红染色和 Masson 染色结果表明,牛蒡苷元治疗组(2 mg/ ml)可以明显抑制增生性瘢痕的形成。与模型组相比,牛蒡苷元治疗组的瘢痕较平坦,成纤维细胞的数量减少,胶原的密度降低。并且 Western 印迹的结果表明,牛蒡苷元治疗组(2 mg/ ml)能够使 MMP-2, MMP-9表达降低。结论牛蒡苷元能有效抑制增生性瘢痕的发展,其机制可能是通过下调 MMP-2和 MMP-9的表达。牛蒡苷元可能具有治疗增生性瘢痕的作用。     

温阳生精汤对肾阳虚不育大鼠睾丸Smads基因表达的调控

目的 探讨转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）超家族的细胞内信号内转导分子Smads（mother against dpp）基因腺嘌呤致雄性肾阳虚不育大鼠睾丸中表达的定位和分布及温阳生精汤对Smads基因表达的调控作用。方法 将实验大鼠随机分为3组,分别为正常对照组、肾阳虚不育组和温阳生精汤组。应用免疫组织化学SABC法和半定量RT—PCR法检测实验大鼠睾丸中Smad1、Smad2、Smad4的定位和分布,并通过图像分析系统进行统计学分析;应用放射免疫法测定血清中睾酮（testosteone,T）、促黄体激素（luteinizing hormone,LH）和促卵泡激素（follicle—stimulating hormone,FSH）含量;同时测定大鼠体重、睾丸和附睾重量及精子数量。结果 Smad1和Smad2在实验大鼠睾丸的各级生精细胞中均有表达,其免疫反应阳性物质位于细胞质内,Smad2在支持细胞的胞质内亦可见阳性表达,两者在间质细胞呈阴性反应;Smad4在实验大鼠睾丸间质细胞的胞质内有表达,生精细胞及支持细胞呈阴性反应。肾阳虚不育组大鼠睾丸中Smad1的表达明显低于正常对照组（P〈0．05）,Smad2和Smad4的表达明显强于正常对照组（P〈0．05）。温阳生精汤能明显增加Smad1在肾阳虚不育大鼠睾丸中的表达（P〈0．05）,降低Smad2和Smad4的表达（P〈0．05）。与正常对照组比较,肾阳虚不育组大鼠体重明显下降,附睾的精子数量明显减少;血清中T显著降低,FSH、LH增高（P〈0．05）;而各实验组大鼠睾丸及附睾重量无明显变化（P〉0．05）;温阳生精汤组大鼠体重和精子数量较肾阳虚不育组显著增加;血清T水平增加,FSH、LH水平降低（P〈0．05）。结论 温阳生精汤不仅能够通过提高肾阳虚不育大鼠血清中T水平,降低FSH和LH水平,增加大鼠的精子数量;而且可以通过调控大鼠睾丸中TGF-β超家族的细胞内信号转导分子Smads基因的表达水平,直接或间接地影响T、FSH和LH水平,促进精子生成,达到治疗男性不育的目的。     

荧光内参在校正Caspase-3/7活性检测偏差中的应用

目的 改进Caspase-3/7活性检测方法.方法 在顺铂诱导的HeLa细胞凋亡模型中,分别利用传统的和改良的实验方法检测Caspase-3/7的活性变化,并与Western印迹实验结果进行方法学比较.结果 改良的实验方法显示不同剂量顺铂诱导下,HeLa细胞Caspase-3/7活性有剂量依赖性增高,与Western印迹实验结果相一致,但传统实验方法显示HeLa细胞Caspase-3/7活性呈现先增高后降低的趋势.结论 由于参测细胞数不同,导致这种Caspase-3/7活性检测方法不能真实反映细胞凋亡程度.本研究成功建立了一种新的改良型Caspase-3/7活性检测方式,这种检测方法可以排除不同凋亡诱导方式诱导细胞凋亡时所产生的因参测细胞数不同所造成的Caspase-3/7活性检测的误差.     

人骨形成蛋白2在昆虫杆状病毒表达系统中的表达及初步鉴定

目的:研究hBMP2在昆虫杆状病毒系统中的表达规律。方法:将编码hBMP2的全长cDNA克隆入转移载体PK8中,重组后的载体与线性化的病毒DNA经脂质体包裹转染昆虫细胞。重组病毒经蓝白筛选后,提取病毒DNA进行PCR扩增,鉴定目的基因。收集重组病毒感染4d的细胞,进行免疫荧光及电子显微镜观察。结果:含有目的基因的重组载体经酶切可切下相应大小的目的基因片段。PCR产物的电泳结果表明,有目的基因片段的扩增。免疫荧光染色呈阳性的颗粒分布在昆虫细胞的胞浆及胞膜。结论:初步证实,hBMP2在此套表达系统中获得了表达。     

环氧合酶2 mRNA 3’UTR荧光素酶报告基因载体的构建

目的:通过构建环氧合酶2(COX2)mRNA 3’UTR的全长及其截短体荧光素酶报告基因载体,为研究COX2基因在炎症条件下的的转录后调控提供有效的工具。方法:通过从胃癌细胞SGC-7901提取RNA,反转录成cDNA后,以此为模板,PCR扩增COX2 3’非翻译区(3’-UTR)全长及截短的序列,并将该序列连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-control,构建pGL3-COX2 3’UTR全长及pGL3-COX23’UTR不同截短体。测序后将上述载体分别与pRL-TK载体共转染293-T细胞,48 h后裂解细胞检测荧光素酶的活性。最后通过ELISA检测在IL-1β的刺激下COX2的下游产物PGE2的表达,并再次测定pGL3-COX2 3’UTR全长的荧光素酶活性。结果:成功构建了pGL3-COX2 3’UTR全长及pGL3-COX23’UTR不同截短体,荧光素酶报告系统表明COX2 3’UTR对基因表达具有较强的调控作用。而在炎症因子IL-1β的刺激下,pGL3-COX2 3’UTR全长荧光素酶的活性明显升高。结论:成功构建了COX2 mRNA 3’UTR荧光素酶报告基因载体并证明在IL-1β的刺激下COX2表达上调,参与转录后调控。     

RNA 结合蛋白 QKI 吸附海绵载体的构建及其对肝癌细胞增殖的影响

目的：构建针对 RNA 结合蛋白 quaking (QKI)的特异性吸附海绵载体(QRE-sponge),验证其对肝癌细胞系 HepG2中内源性 QKI 分子的抑制作用。方法利用人源 QKI 的特异性识别效应原件(qua-king responsive element, QRE)序列,重复13个拷贝,串联克隆至 pEGFP-C2真核表达载体中,转染 HepG2肝癌细胞及293 T 细胞。通过 Real time PCR,双荧光素酶报告基因检测及 MTT 实验进一步验证该吸附海绵的效果及其对肝癌细胞系 HepG2增殖的影响。结果 pEGFP-C2-QRE-SP 载体经测序证实构建成功,可以成功的在 HepG2细胞中表达,其绿色荧光呈阳性,且转染24 h 后显著影响 HepG2细胞中 QKI 下游靶基因的表达(P ﹤0.05)。双荧光素酶报告基因系统显示, pGL3-QRE-SP 载体可以显著抑制外源性 QKI 的活性(P﹤0.05)。 MTT 结果显示 pEGFP-C2-QRE-SP 载体促进 HepG2细胞的增殖。结论 QKI 吸附海绵载体策略构建的 pEGFP-C2-QRE-SP 载体可以成功的诱骗吸附 QKI,并促进肝癌细胞系 HepG2增殖,为进一步研究 QKI的功能研究提供了良好工具。     

医学研究生分子生物学实验教学的体会

分子生物学实验技术既是分子生物学的重要组成部分,也是学科藉以发展所不可或缺的工具。对于分子生物学实验课的教学,通过教学实践,对于实验课教学内容的安排、教学形式的选择以及追求怎样的教学效果等问题提出了思考与看法。