Mutation screening of the F Ⅷ gene in 10 hemophilia A families

Objective To identify the F Ⅷ gene mutations of patients and suspected female carriers in 10 Hemophilia A (HA) families, and to guide the prenatal diagnosis. Methods PCR, denaturing high performance liquid chromatogramphy(DHPLC) and DNA sequencing technologies were applied to screen the FⅧ gene of 8 HA patients and 12 suspected female carriers in the 10 families. Linkage analysis was performed by using St 14 (DXS 52), intron 13 (CA)n and EX18/Bcl Ⅰ of the FⅧ gene in the HA families.In prenatal diagnosis, we screened the same mutation found in the patients. PCR-restriction fragment length polymorphism was applied to detect the new missense mutations of F Ⅷ gene in 100 unrelated healthy individuals to exclude the possibility of polymorphism. Results (1) Five missense mutations, 3 frameshift mutations, 2 nonsense mutations and 2 single nucleotide polymorphism(SNP) were identified in 10 the HA families. Among them, c. 878A＞G, c. 1015A＞G, c. 6870G＞T, c. 1282delA, c. 3072_3073insT, c. 4880_4881insA and c. 5000G＞A were novel mutations or polymorphism. No missense mutations c. 878A＞G, c.1015A＞G and c. 6870G＞T, were found in the 100 healthy unrelated controls. (2) Nine suspected female carriers were confirmed at the gene level. (3) X risk chromosome could be determined in 4 HA families by genetic linkage analysis. (4) Among the four fetuses for prenatal diagnosis, 2 were normal, 1 was carrier and the remaining 1 was a patient. Conclusion Six novel mutations, i. e. , c. 878A＞G, c. 1015A＞G, c.6870G＞T, c. 1282delA, c. 3072_3073insT and c. 4880_4881insA, were identified in this study. PCR,DHPLC and DNA sequencing could be used to screen the gene mutations of HA patients, to carry out carrier detection and prenatal diagnosis of HA families efficiently, by combining with restriction endonuclease analysis and genetic linkage analysis.     

一种精子无冷冻保护剂玻璃化冷冻新载体制备

目的制备一种新型无冷冻保护剂精子玻璃化冷冻载体。方法与开放式精子载体相比较,对精子冷冻前后活动率和存活率进行比较,结果显示冷冻复苏后精子活动率分别为（70±2）%和（65±3）%,存活率分别为（74±4）%和（66±3）%。结论本新型冷冻载精子具有良好的冷冻效果,精子悬液可在新型载体形成比较薄的液体层,并且具有良好的液体承载量,是一种良好的无冷冻保护剂精子玻璃化冷冻载体。     

全胚冷冻后行FET避免IVF/ICSI-ET助孕治疗中、重度OHSS发生风险

目的 比较对于体外受精/胞浆内单精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)助孕后有OHSS高风险患者进行鲜胚移植或取消鲜胚移植行全胚冷冻、冻胚移植两种不同处理方式对助孕结局的影响.方法 回顾性分析2010年1～12月在该院生殖中心接受IVF/ICSI-ET助孕存在OHSS发生高风险的共1578例患者临床资料,比较行鲜胚移植或取消移植行全胚冷冻后冻胚移植(FET)两种不同处理方式所获得的妊娠结局及处理后OHSS发生率.结果 2010年鲜胚移植共计9009周期,OHSS高风险患者共计1578周期(E2≥4000pg/mL或取卵数≥30个).OHSS高风险患者进行鲜胚移植为1284周期,其临床妊娠率为60.9％;全胚冻存294周期,行首次FET为250周期,临床妊娠率54.0％(P＜0.05);两组的着床率分别为39.7％(1111/2802)和35.7％(185/518),流产率分别为9.7％(76/782)和8.9％(12/135).OHSS高风险患者进行鲜胚移植后发生重度OHSS共46周期,其发生率为3.6％(46/1284),高于全胚冷冻组0.3％(1/294),亦高于全年度非OHSS高风险鲜胚移植患者的1.3％(100/7725周期)(P＜0.05).结论 OHSS高风险患者进行全胚冷冻后冻胚移植首周期较鲜胚移植能有效避免重度OHSS的发生.     

视锥视杆细胞同源盒基因的慢病毒载体的构建

目的 构建视紫红质启动子(rhodopsin,Rho)驱动的、大鼠视锥视杆细胞同源盒基因(cone-rod homeobox gene,CRX)为目的基因的重组慢病毒载体LV-Rho-EGFP/CRX,研究其在体外的转染效率.方法 用PCR法扩增质粒pEGFP-C3/CRX中的EGFP/CRX基因片段,取代慢病毒载体LV-Rho-EGFP中的EGFP片段,构建表达载体LV-Rho-EGFP/CRX,经酶切和双向测序验证.用磷酸钙沉淀法四质粒共转染293T细胞,包装、收集病毒,利用有限稀释法测定病毒滴度.用慢病毒原液感染光感受器细胞来源的人视网膜母细胞瘤细胞株HXO-RB44,观察感染情况.结果 成功构建慢病毒表达载体LV-Rho-EGFP/CRX,产生的慢病毒滴度为2×104 IU/ml,感染48h后,HXO-RB44细胞内可见强弱不等的绿色荧光.结论 重组载体LV-Rho-EGFP/CRX产生的慢病毒能感染光感受器细胞来源的HXO-RB44细胞,但还需提高转染的效率和滴度.     

小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞

目的 建立小鼠胚胎干细胞(mESCs)分化为胰岛素分泌细胞的体外诱导体系。方法mESCs经拟胚体(EB)阶段,筛选出nestin阳性细胞,扩增培养后,用不同浓度烟碱对nestin阳性细胞进行诱导,观察诱导细胞的形态变化,并进行免疫组化染色、流式细胞仪分析和胰岛素分泌实验。结果 不同大小EB中nestin阳性细胞比例不同,直径为100μm大小EB中较多。nestin阳性细胞经烟碱诱导15d后,可形成分泌胰岛素的胰岛样细胞团,大部分细胞团胰岛素抗体检测为阳性。以10mmol/L烟碱诱导分化后得到的胰岛素分泌细胞较0mmol/L和5mmol/L多,这些细胞在不同浓度葡萄糖刺激下能分泌不同量胰岛素。结论10mmol/L烟碱诱导小鼠ESCs 15d,可获得较多胰岛素分泌细胞。     

生精相关基因mTSARG3的原核表达和抗体制备

目的 构建小鼠生精相关基因pGEX-KG/mTSARG3重组载体,进行原核表达和多克隆抗体制备.方法 应用RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mTSARG3的开放阅读框,T-A克隆后将mTSARG3插入到原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入宿主菌E.coliBL21,IPTG诱导表达GST/mTSARG3融合蛋白,采用SDS-PAGE和Westernblotting对融合蛋白进行分析和鉴定.以融合蛋白为免疫原免疫家兔,制备抗mTSARG3多克隆抗体并进行Westernblotting鉴定.结果 成功构建了pGEX-KG/mTSARG3重组质粒,测序结果与预期一致;转化重组质粒的E-coliBL21经IPTG37℃诱导4h后高效表达GST/mTSARG3融合蛋白:Westernblotting实验结果显示制备抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了mTSARG3基因的原核表达和多克隆抗体制备,为下一步的功能研究奠定基础.     

人类胚胎干细胞

<正>干细胞(stem Cell)研究成果曾被Science评为1998年世界科技十大成果之首、2000年世界科技十大成果之一和六大热点发展领域之首。1998年人胚胎干细胞建系后,研究者开始真正重视干细胞产业,全球掀起以人胚胎干细胞为中心的干细胞研究和应用热潮,并带来广阔的产业化前景。     

DNA指纹技术在可疑精子标本等鉴定中的应用

目的：应用DNA指纹技术对精子库供精者中来源可疑的精子标本进行鉴定,并对供精者的后代进行亲子鉴定。方法：分别对本研究室所涉及的6名供精者的精子标本及其对应可疑精子标本各一份,同时志愿者精子和其儿子外周血各一份提取DNA,应用PCR扩增,PAGE胶电泳检测DNA指纹图。结果：通过DNA指纹图分析,5个可疑精子标本被确定为对应同一供精者精子标本,余1例被确认为非同一供精者精子标本来源;志愿者和其儿子被确定为亲子关系。结论：应用DNA指纹图技术对精子库供精者的可疑精子标本和供精者精子及对应供精者精子和后代外周血进行分析,可以对其来源进行准确的鉴定。     

骨髓成纤维细胞条件培养液对体外巨核系细胞生成的促进作用

目的：探讨骨髓成纤维细胞条件培养液对体外巨核系细胞生成的促进作用。方法：制备骨髓成纤维细胞条件培养液(bone marrow fibroblasts conditioned medium ,BMF-CM),分别观察BMF-CM或BMF-CM联合IL-11对体外培养条件下成熟巨核细胞生成的影响及BMF-CM对巨核系祖细胞生成的影响,并用RT-PCR的方法检测Meg-01人巨核细胞系细胞NF-E2 mRNA的表达。结果：BMF-CM促进成熟巨核细胞生成。BMF-CM联合IL-11促进成熟巨核细胞生成的效果更佳。BMF-CM能促进巨核系祖细胞的生成。将30％BMF-CM加入Meg-01人巨核细胞系培养体系培养4　h,与对照组相比,NF-E2表达增强。结论：骨髓成纤维细胞条件培养液对体外巨核系细胞生成有促进作用。     

两种条件培养基促进鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞

目的:从鼠胚胎干细胞获得具有造血重建功能的造血干细胞.方法:将ES-D3细胞形成4天拟胚体(4dEBs),再用骨髓内皮细胞条件培养液(mBMEC-CM)和/或胎肝基质细胞条件培养液(FLSC-CM)诱导4dEBs生成造血干细胞.实验为mBMEC-CM FLSC-CM组、mBMEC-CM组、FLSC-CM组,对照组.检测诱导生成的细胞造血干细胞特异抗原表达、造血相关基因表达、造血集落的形成以及造血重建能力.结果:从诱导ES-D3细胞生成造血干/祖细胞的数量和生成的集落总数看,mBMEC-CM FLSC-CM组诱导效率显著高于其他3组.mBMEC-CM FLSC-CM组诱导生成的细胞能重建照射鼠的造血系统.结论:骨髓内皮细胞条件培养液联合胎肝基质细胞条件培养液可促进鼠胚胎干细胞分化为具有造血重建能力的造血干细胞.