Dysregulation of microRNAs in a mouse model of diabetic myocardial fibrosis

Background Myocardial fibrosis plays a critical role in the process of diabetic cardiac remolding.MicroRNAs (miRNAs) are endogenous,small non-coding RNAs that negatively regulate gene expression in diverse biological and pathological processes.However,the roles of miRNAs in myocardial fibrosis have not been well elucidated.In the present study,miRNAs profiles in the fibrotic myocardium of db/db mice and miRNAs expression in TGF-β1-stimulated mouse cardiac myofibroblasts was examined.Methods Heart function of 18-week-old db/db mice and db/m control mice was detected by echocardiography.miRNA expression profile in diabetic myocardium was detected by miRNA microarray.Quantitative real-time PCR was used to determine the expression of fibrosis-related genes and miRNA precursors of interest.Western blot was used to detect the levels of fibrosis-related proteins,activated Smad3 and total Smad3.Results The result of echocardiography showed that left ventricular systolic and diastolic function was impaired in 18-week-old db/db mice without significant change of ejection fraction (EF) and fractional shortening (FS).Fibrosis-related genes expression was upregulated and the amount of phosphorylated Smad3 was increased significantly in the diabetic myocardium.miRNAs dysregulation was shown in diabetic myocardium,sixty-eight miRNAs,including miR-208b,miR-29b,miR-26b and miR-30e,were increased over two-fold,meanwhile,sixty-two miRNAs were decreased more than two-fold in the myocardium of db/db mice compared to db/m controls.In parallel with a significant upregulation of Col1a1,Col3a1 and CTGF miRNA expression,miR-208b,miR-29b,miR-26b and miR-30e precursors were also shown to be upregulated in TGF-β1-induced C57bl/6 mouse cardiac myofibroblasts.Conclusions microRNAs were dysregulated in diabetic myocardium,with the activation of TGF-β/smad3 pathway,contributing to diabetic myocardial fibrosis.     

腺病毒表达载体对骨髓间充质干细胞分化能力的影响

目的 研究腺病毒感染骨髓间充质干细胞(MSC)对MSC分化潜能的影响.方法 利用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒感染传至3代的人MSC,分别在感染后第2、4、8和16天收集细胞,提取总RNA,利用RT-PCR检测感染前后MSC中内胚层标志基因CYP51、中胚层标志基因SM22α、外胚层标志基因槽蛋白(nestin)、多分化潜能标志基因OCT4和可变剪切因子基因nPTB的表达.在腺病毒感染MSC 7 d后,利用成脂肪诱导剂继续诱导培养14 d,用油红O染色观察MSC向脂肪细胞分化情况.结果 RT-PCR检测显示,MSC中CYP51、SM22α、nestin、OCT4和nPTB在腺病毒感染后2、4、8和16 d时仍有表达.腺病毒感染7 d后的MSC仍可向脂肪细胞分化,且分化效率同正常MSC一致.结论 腺病毒载体感染MSC后,不会影响MSC的分化能力,可以作为MSC诱导分化机制研究的基因表达载体.     

HERG基因转染HEK293细胞及其编码通道电流的记录

目的建立HERG基因在HEK293细胞稳定表达的方法。方法利用Lipofectamine2000将pCDNA3.0-HERG转染进入HEK293细胞,通过G418筛选阳性克隆细胞系,采用免疫荧光细胞化学方法检测该蛋白的表达,用全细胞膜片钳技术测定HERG基因介导的快速激活延迟整流钾电流(Ikr)。结果免疫荧光细胞化学检测证实转染HEK293细胞中HERG通道蛋白的表达,膜片钳全细胞实验记录到Ikr。结论该方法有效地将HERG基因转染进入HEK293细胞,并稳定表达HERG通道蛋白及介导Ikr。     

重组人神经肽Y受体Y2融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究

目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y Y2受体,并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析.方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28a-Y2转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS-PAGE检测和Western 印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni~(2+)-NTA亲和层析纯化.然后利用相关在线软件进行生物信息学分析Y2受体蛋白.结果 经IPTG诱导含有pET28a-Y2重组质粒的DE3菌,表达出重组人Y2融合蛋白.重组蛋白经Ni~(2+)-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白.经相关在线软件分析后获得了Y2受体的相关生物学特性.结论 重组质粒pET28a-Y2在大肠杆菌DE3中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白,并对Y2受体蛋白的生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础.     

circRNA001131通过结合miR-25-3p抑制心肌成纤维细胞中纤维化相关基因的表达

目的:研究环形RNA(circRNA)001131对大鼠心肌成纤维细胞(CFs)纤维化表型的影响及分子机制。方法:采用Masson三色染色法对腹主动脉缩窄(AAC)手术诱导的心肌重构大鼠心肌进行胶原纤维的染色观察。利用芯片检测AAC手术诱导的大鼠心肌中circRNA表达谱的变化。RT-qPCR检测AAC大鼠心肌及血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)诱导的大鼠CFs中circRNA001131的表达。利用放线菌素D和RNase R实验检测circRNA001131的稳定性。利用重组circRNA001131腺病毒(rAd-circRNA001131)感染大鼠CFs,检测CFs中纤维化相关基因Ⅰ型胶原α1链(Col1a1)、Ⅲ型胶原α1链(Col3a1)和肌动蛋白α2(Acta2)的mRNA和蛋白表达。双萤光素酶报告基因实验验证circRNA001131与miR-25-3p的结合作用。结果:RT-qPCR结果证实,circRNA001131在AAC手术诱导的大鼠心肌和Ang-Ⅱ处理的大鼠CFs中表达增强。放线菌素D和RNase R实验结果显示,circRNA001131与其宿主基因--第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(Pten)mRNA相比,降解水平明显降低。过表达circRNA001131可显著抑制大鼠CFs中纤维化相关基因Col1a1和Col3a1的表达。双萤光素酶报告基因实验证实circRNA001131与miR-25-3p间存在结合作用,miR-25-3p可以减弱circRNA001131对大鼠CFs中纤维化相关基因表达的抑制作用。结论:circRNA001131在心肌纤维化中表达增强,并通过结合miR-25-3p发挥抑制心肌纤维化的作用。     

用三七总皂苷与卡维地洛治疗AMI后大鼠改善心功能作用的疗效比较与评价

目的研究三七总皂苷与卡维地洛对心肌梗死后大鼠左室心功能改善作用的疗效并比较评价。方法手术法结扎左冠状动脉前降支建立SD大鼠AMI模型36只,将模型鼠随机分为心梗对照组（AMI组）,三七总皂苷治疗组(PNS组,80 mg·kg^-1·d^-1)和卡维地洛治疗组(CARV组,6 mg·kg^-1·d^-1),每组12只;另设假结扎组（Sh组,12只）。术后24小时开始灌胃给药,4周后对各组大鼠进行超声心动图心功能和血浆脑钠肽（NT-proBNP）浓度检测。结果 （1）与Sh组比较,AMI组左室射血分数（EF）和左室收缩百分率（FS）、室间隔舒张、收缩末期厚度（IVSd、IVSs）与左室前壁收缩末期厚度（LVAWDs）均明显降低（P<0.01）,左室舒张、收缩末期内径（LVIDd、LVIDs）显著增加,且左室后壁收缩末期厚度（LVPWDs）明显增加（P<0.05）。而二尖瓣血流E/A比值下降明显;心肌运动应变率（Radial Strain Rate）减小,达峰时间（TPK,ms）明显延长;NT-proBNP浓度显著增高（P<0.01）。（2）与AMI组比较,PNS组和CARV组的EF、FS、IVSd、IVSs与LVAWDs明显增加,而LVIDd、LVIDs和LVPWDs明显降低（P<0.01）;且心肌运动应变率明显增加,达峰时间明显缩短;NT-proBNP浓度明显降低。（3）PNS组与CARV组比较,PNS组的EF、FS和LVAWDs增加显著,LVIDd、LVIDs减小明显;而IVSd、IVSs、和LVPWDs无明显差异（P>0.05）。并且,PNS组的二尖瓣血流E峰、A峰和E峰下降速率均明显增大（P<0.05）,而E/A比值和心肌应变率、达峰时间与NTproBNP浓度两组无明显差异。结论心肌梗死后大鼠的左心室收缩和舒张功能异常严重;用三七总皂苷和卡维地洛治疗4周后均能明显改善其心功能,防止心衰;但PNS在提高EF、LVAWDs和二尖瓣血流方面更优于卡维地洛。     

恶性疟原虫海南株膜抗原Pf7、Pfl2基因的体外扩增

Pf7、Pfl2基因是恶性疟原虫红内期阶段虫体表面膜抗原。根据已知的Pf7、Pfl2基因序列．自行设计并合成引物。应用PCR技术，从恶性疟原虫海南株(FCCl／HN)基因组中特异扩增出Pf7、Pfl2基因，其片段太小分别约为800bp、1040hp，为进一步克隆、测序奠定了基础。     

巨噬细胞移动抑制因子基因的克隆和原核表达

目的：扩增、克隆人巨噬细胞移动抑制因子（MIF）基因，并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的重组MIF蛋白。方法：根据人MIF基因序列，设计、合成PCR引物，利用RT-PCR技术从人T淋巴细胞mRNA中扩增MIF基因。将MIF定向插入原核表达载体pGEX-4T-1，并将构建正确的重组表达载体pGEX-4T-MIF转化工程菌BL21(DE3)，用异丙基硫代-β-D-半乳糖（IPTG）诱导表达重组MIF蛋白。用GSTrap亲合柱纯化表达产物GST-MIF，行柱上凝血酶消化，洗脱获得MIF蛋白。用巨噬细胞移动抑制试验（MMI）鉴定MIF蛋白的生物活性。结果：限制性内切酶分析和DNA测序结果表明，成功构建了重组质粒pGEX-4T-MIF，人MIF cDNA长348 bp，编码115个氨基酸。经IPTG诱导，高效表达出可溶的GST-MIF蛋白。SDS-PAGE 和 Western blotting分析显示，GST-MIF经凝血酶消化，获得13 kU的MIF蛋白。MIF蛋白对巨噬细胞移动的抑制率达30%，具有生物活性。结论：克隆、测定了人MIF基因，在大肠杆菌表达出具有生物活性的MIF蛋白。     

恶性疟原虫红内期p41—3基因真核表达重组质粒的构建及序列分析

目的 构建恶性疟原虫海南（FCC1／HN）株p41-3基因真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3,测定p41-3基因序列,并了解FCC1/HN株与其它分离株p41-3序列的差异。方法 根据p41-3基因已知序列设计合成3对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增p41-3基因;将p41-3基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;用酶切,PCR扩增鉴定筛选到的重组质粒阳性克隆。以正确的重组质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定p41-3基因序列,应用软件辅助分析p41-3序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1/HN株p41-3基因;正确的pcDNA3-p41-3重组质粒被筛选和鉴定。测序表明,FCC1／HN株p41-3基因大小为2137bpo,编码375个氨基酸,恶性疟原虫FCC1/HN株与FCBR株p41-3基因核苷酸序列同性为98．98％,编码氨基酸序列同源性为99．73％。结论 从恶性疟原虫FCCl/HN株 基因组DNA中获取p41-3基因,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3,并测定了FCC1／HN株p41-3基因的序列;FCC1／HN株与其它分离株p41-3基因有高度的同源性。