糖尿病性心肌纤维化中上调表达长链非编码RNA（1ncRNA）的鉴定

目的鉴定在糖尿病性小鼠心肌和糖尿病性心肌纤维化细胞模型中一致上调表达的长链非编码RNA（1ncRNA）。方法通过Masson染色检测糖尿病db／db小鼠和db／m对照小鼠心肌中的胶原含量。用小鼠lncRNA表达谱芯片检测小鼠心肌中lncRNA表达,用荧光定量PCR鉴定6个代表性的在糖尿病性心肌中高表达的lncRNAs。用33mmol／L葡萄糖分别和0．1、0．2、0．4、0．6mU葡萄糖氧化酶处理小鼠心肌成纤维细胞,通过检测纤维化相关基因仪．SMA、Collal和Col3al表达来确定合适的葡萄糖／葡萄糖氧化酶（HG／Go）处理条件。用确定条件的HG／Go处理小鼠心肌成纤维细胞,用荧光定量PCR鉴定在糖尿病性心肌和糖尿病性心肌纤维化细胞模型中一致上调表达的lncRNA。结果Masson染色显示,糖尿病db／db小鼠心肌的胶原含量显著升高,与对照小鼠比较差异有统计学意义（P〈0．01）。同db／m对照小鼠相比,糖尿病db／db小鼠心肌中lncRNA出现差异性表达,其中354个lncRNAs呈1．5倍以上高表达,292个lncRNAs呈1．5倍以上下调表达。检测的6个代表性上调表达的lncRNAs中,AK014842、AK076377和BF607975表达在糖尿病性心肌中显著上调。33mmol／L葡萄糖结合0．2、0．4mUGo可以有效上调小鼠心肌成纤维细胞中α—SMA和Col3al表达。荧光定量PCR结果显示,AK014842和BF607975在33mmol／L葡萄糖结合0．2mUGo处理的小鼠心肌成纤维细胞中表达显著升高。结论LncRNAAK014842和BF607975在糖尿病性心肌和糖尿病性心肌纤维化细胞模型中一致上调表达。     

人微小RNA-16(miR-16)重组腺病毒的制备和鉴定

目的 制备人微小RNA-16(miR-16)重组腺病毒,研究其在人骨髓间充质于细胞(hMSCS)中的表达及对细胞周期素依赖蛋白激酶6(CDK6)表达的影响.方法 从人基因组DNA中扩增miR-16前体的DNA,定向插人腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV.将经Pme I线性化的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-m...     

肝螺杆菌脂多糖提取及纯化方法的建立

目的建立肝螺杆菌脂多糖（LPS）提取与纯化方法。方法采用脂多糖提取试剂盒提取肝螺杆菌LPS,并用DNaseI和RNase酶除去DNA和RNA,纯化LPS。三次测定LPS中糖、蛋白质及核酸的含量,并用SDS．PAGE电泳银染方法分析LPS纯度。结果肝螺杆菌为形态细小、Giemsa’8染色阴性的不规则螺旋型杆菌。纯化的LPS平均产率为0．202％,平均蛋白质含量为0．365g／L,平均核酸含量为0．413mg／L,三者结果的稳定性好,批间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。SDS．PAGE电泳结果显示,LPS提取物与标准品比较,主要条带清晰,位置相同。结论建立了一种有效提取肝螺杆菌LPS的方法,该方法简便可行、提取物纯度高,核酸及蛋白质含量低,值得推广应用。     

AngⅡ通过AP-1调控内皮细胞中巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的表达

目的 明确介导AngⅡ调控人内皮细胞中巨噬细胞移动抑制因子(migration inhibitory factor,MIF)表达的转录因子.方法 构建长度依次递减的MIF基因5'调控区的荧光报告基因表达载体,并将其转化入人脐静脉内皮细胞EAhy926.利用双荧光基因报告系统检测AngⅡ诱导后MIF基因5'调控区不同区段的转录活性.通过突变转录活性高的MIF 5'调控区序列.初步确定可能的转录因子结合序列.设计针对可能的转录因子的小干扰RNA(siRNA)序列,并构建其表达载体,分别检测候选转录因子沉默的HEAY926中MIF的转录活性和表达水平.结果 双荧光基因报告检测显示,Ang Ⅱ调控MIF表达的高转录活性区段位于-507至-188之间.序列突变和荧光素酶活性分析显示,MIF基因5'调控区-350至-339问的AP-1结合序列决定了MIF基因的转录活性.AP-1沉默后的HEAY926中AngⅡ调控的MIF转录活性显著降低(P<0.05),MIF mRNA和蛋白的表达水平也显著降低(P<0.05).结论 AngⅡ通过转录因子AP-1调控内皮细胞中MIF的表达.     

大蒜素对大鼠离体肾内动脉血管张力的影响

目的观察大蒜素（Allicin）对离体肾内动脉经血管收缩剂预收缩张力的影响,探讨其对微血管的作用机制。方法显微操作下取SD大鼠肾内动脉,制备成1.8～2.0 mm长的血管条,用两根不锈钢丝穿过血管腔,固定于微血管测定仪的浴槽内,置于37℃通有混合气体（95%O₂+5%CO₂）的生理盐溶液中。平衡1小时后,分别给予受体依赖性血管收缩剂苯肾上腺素（phenylephrine,PE）1μmol·L^-1、5-羟色胺（5-hydroxy tryptamine,5-HT）2μmol·L^-1、血栓素A2类似物U46619 100 nmol·L^-1和非受体依赖性血管收缩剂60mmol·L^-1 KCL预收缩血管,采用累积给药法加入大蒜素,观察不同浓度的大蒜素对血管张力的影响。结果大蒜素对PE、5-HT、U46619预收缩内皮完整的血管环,均呈浓度依赖性的舒张血管作用;对PE预收缩用一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(100 mmol·L^-1)孵育30 min保留内皮的血管环以及采用机械法去除内皮的血管环,均呈浓度依赖性的舒张血管作用,与内皮完整组无比较统计学差异;对KCL预收缩内皮完整的血管环,各浓度的大蒜素均无明显的舒张血管作用。结论大蒜素对PE、5-HT、U46619预收缩的血管环具有浓度依赖性舒张作用,对KCL预收缩的血管环无舒张作用。提示其舒张血管的作用与受体途经有关,与L型钙通道途经无关,并且对PE预收缩血管的舒张作用不依赖于内皮功能的完整性。     

用三七总皂苷与卡维地洛治疗AMI后大鼠改善心功能作用的疗效比较与评价

目的研究三七总皂苷与卡维地洛对心肌梗死后大鼠左室心功能改善作用的疗效并比较评价。方法手术法结扎左冠状动脉前降支建立SD大鼠AMI模型36只,将模型鼠随机分为心梗对照组（AMI组）,三七总皂苷治疗组(PNS组,80 mg·kg^-1·d^-1)和卡维地洛治疗组(CARV组,6 mg·kg^-1·d^-1),每组12只;另设假结扎组（Sh组,12只）。术后24小时开始灌胃给药,4周后对各组大鼠进行超声心动图心功能和血浆脑钠肽（NT-proBNP）浓度检测。结果 （1）与Sh组比较,AMI组左室射血分数（EF）和左室收缩百分率（FS）、室间隔舒张、收缩末期厚度（IVSd、IVSs）与左室前壁收缩末期厚度（LVAWDs）均明显降低（P<0.01）,左室舒张、收缩末期内径（LVIDd、LVIDs）显著增加,且左室后壁收缩末期厚度（LVPWDs）明显增加（P<0.05）。而二尖瓣血流E/A比值下降明显;心肌运动应变率（Radial Strain Rate）减小,达峰时间（TPK,ms）明显延长;NT-proBNP浓度显著增高（P<0.01）。（2）与AMI组比较,PNS组和CARV组的EF、FS、IVSd、IVSs与LVAWDs明显增加,而LVIDd、LVIDs和LVPWDs明显降低（P<0.01）;且心肌运动应变率明显增加,达峰时间明显缩短;NT-proBNP浓度明显降低。（3）PNS组与CARV组比较,PNS组的EF、FS和LVAWDs增加显著,LVIDd、LVIDs减小明显;而IVSd、IVSs、和LVPWDs无明显差异（P>0.05）。并且,PNS组的二尖瓣血流E峰、A峰和E峰下降速率均明显增大（P<0.05）,而E/A比值和心肌应变率、达峰时间与NTproBNP浓度两组无明显差异。结论心肌梗死后大鼠的左心室收缩和舒张功能异常严重;用三七总皂苷和卡维地洛治疗4周后均能明显改善其心功能,防止心衰;但PNS在提高EF、LVAWDs和二尖瓣血流方面更优于卡维地洛。     

大鼠活体心肌缺血再灌注损伤模型的建立与综合评估

目的: 构建并评估大鼠活体心肌缺血再灌注损伤(I/R)的实验动物模型。 方法: 将清洁级成年SD雄性大鼠72只,随机分为正常组、假结扎组和I/R模型组, 手术的两组全麻下开胸暴露心脏,假结扎组只过线不结扎,模型组使用"U形金属管"进行冠状动脉左前降支结扎,持续心电图监测,并于再灌注2 h与4 h后进行血浆生化﹑心肌组织学的检测。结果: 与正常组和假结扎组比较,I/R模型组心电图有明显ST-T改变和再灌注后病理性Q波,再灌注2 h和4 h时存在比较明显的ST-T改变;血标本检测示心肌型肌酸激酶同功酶(CK-MB)、心肌钙蛋白I(cTnI)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平显著升高(P<0.05或P<0.01),T-SOD水平在2 h和4 h也应激性升高(P<0.05);心肌组织病理学检测显示模型组左心室心肌损伤疤痕明显,且2 h模型组左室心肌存在间隔性梗死区域,4 h模型组心肌组织区域性梗死和梗死面积明显增加;TUNEL法与Bcl-2﹑Bax蛋白实验显示2 h和4 h心肌细胞凋亡数量明显增加;Bcl-2/Bax蛋白表达阳性细胞比值下降显著(P<0.01)。 结论: 成功建立大鼠活体心肌I/R模型,模型大鼠的心电图、血清学、心梗面积﹑心肌细胞凋亡和心肌组织病理学等发生显著改变。