核内miR-199b-5p通过上调CDK9表达促进心肌细胞肥大

目的:研究核内微小RNA-199b-5p(miR-199b-5p)对心肌细胞肥大的调控作用及其机制.方法:利用RT-qPCR检测健康人与心衰患者心肌组织中miR-199b-5p的表达水平.通过核质分离及RT-qPCR技术确定miR-199b-5p在人心肌AC16细胞中的核质分布.原代分离培养C57BL/6乳小鼠心室肌细...     

日本血吸虫(中国大陆株)Sj16基因真核表达载体的构建及序列分析

目的为了进一步研究日本血吸虫(中国大陆株)Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识.方法根据曼氏血吸虫Sm1 6基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库中扩增Sj16基因;将Sj16基因定向克隆入pcDNA3,转化感受态DH5a菌;用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆.以重组pcDNA3-Sj16质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定Sj16基因序列,应用软件辅助分析Sj16序列及进行Sj16与曼氏血吸虫的Sm16同源性比较.结果从日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因,成功构建日本血吸虫(中国大陆株)Sj16基因真核表达重组质粒pcDNA3-Sj16;Sj16基因开放读码框有354碱基,编码¨7氨基酸,N端18个氨基酸可能为信号肽序列;Sj16与Sm16有高度同源性,只存在一个氨基酸的差异.结论成功克隆了Sj16基因的真核表达载体,并测定、分析了Sj16基因序列,为深入研究Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下基础.     

恶性疟原虫FCC1/HN(CQS)株Pfmdr1、Cg1基因T-A克隆及序列分析

目的　将恶性疟原虫FCC1/HN株 (CQS)Pfmdr1和Cg1全基因编码区克隆入测序载体 ,测定其序列 ,为以后研究其与疟原虫耐药性的关系奠定基础。方法　利用PCR扩增技术 ,分 3个片段从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中 ,特异扩增Pfmdr1全基因编码序列 ;分 2个片段特异扩增Cg1全基因编码序列。扩增产物经纯化回收后 ,T -A克隆入测序载体 pMD18-T ,转化大肠杆菌 (E coli)JM 10 9,筛选阳性克隆 ,并进行双酶切及PCR扩增鉴定 ,获得阳性重组质粒 ,用Sanger双脱氧链终止法进行DNA测定。结果　CQSFCC1/HN株Pfmdr1基因序列与CQSFc2 7株同源性高 ,全长 4 2 4 8bp ,编码 14 15个氨基酸 ;测得Cg1基因全长为 2 82 0bp ,编码 939个氨基酸 ,存在串联α重复序列。 结论　恶性疟原虫FCC1/HN(CQS)株Pfmdr1和Cg1全基因编码序列的测定 ,为以后研究耐药性虫株的上述基因以及它们与疟原虫耐药性的关系奠定基础。     

高糖诱导H9c2心肌细胞凋亡并激活JNK通路的研究

目的:探讨高糖在H9c2心肌细胞促凋亡和氧化应激的作用以及对JNK通路的影响.方法:以33 mmol/L葡萄糖作为高糖条件培养H9c2细胞,5 mmol/L葡萄糖作为正常代谢对照,DCFH-DA探针检测细胞内活性氧簇(ROS)水平,JC-1探针检测线粒体膜电位(△ψm)变化,AnnexinV/PI结合流式细胞仪检测凋亡率.western blot分析高糖对胞内JNK信号的影响.结果:在高糖条件下H9c2胞内ROS在24 h开始增强,同时△ψm降低,高糖诱导细胞凋亡率为(11.27±3.40)%(P=0.001),并能使JNK激活水平在10 min开始增加(P<0.05).结论:高糖氧化应激压力降低心肌细胞△ψm并导致凋亡,同时激活与凋亡密切相关的JNK通路.     

人血管生成抑制因子canstatin基因的克隆及真核表达

[目的]为研究canstatin对动脉粥样硬化斑块的稳定作用,克隆人canstatin基因,并在COS7细胞中表达出具有生物活性的canstatin.[方法]利用RT-PCR技术,从人脐静脉血管内皮细胞中扩增canstatincDNA,并定向克隆入真核表达载体pSecTag2C中.用脂质体转染法,将重组质粒pSecTag2C-canstatin转入COS7细胞.培养48h后,对转化的COS7细胞行PCR和Western-blot鉴定,用MTT法检测canstatin对人脐静脉血管内皮细胞增殖的抑制作用.[结果]从人脐静脉血管内皮细胞中扩增出canstatincDNA片段.测序结果显示,克隆的canstatincDNA长684bp,序列与文献报道一致.从pSecTag2C-canstatin转化的COS7细胞中能特异地扩增出canstatin基因片段,Western-blot结果显示,转化的COS7细胞中有特异的34kDa的canstatin表达.MTT检测显示,表达canstatin的COS7细胞上清能呈剂量依赖性地抑制脐静脉血管内皮细胞的增殖.[结论]构建了真核表达重组质粒pSecTag2C-canstatin,在COS7中表达出具有生物活性的人canstatin.     

恶性疟原虫子孢子表面蛋白2基因的克隆与序列分析

目的：克隆恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)子孢子表面蛋白2(PfSSP2)基因，并进行序列分析。方法：根据PfSSP2基因已知序列设计合成一对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出PfSSP2基因，并克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测序，用DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN株PfSSP2基因序列，酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-PfSSP2重组质粒。测序表明，所克隆的PfSSP2基因大小为1680bp，编码559个氨基酸残基。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、DD2、FCR3、HB3A、K1、Thai814、Thai838、Thai842、Thai947及7G8株PfSSP2的氨基酸序列在33个位点存在氨基酸替代，1处氨基酸序列增加；各株间PfSSP2的氨基酸序列同源性都在95.7％以上。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株PfSSP2基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫不同分离株间有高度的同源性。     

用小双链RNA抑制转化入HUVEC中绿色荧光蛋白基因的表达

目的：建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs），研究小干扰RNA(siRNA)对HUVECs中GFP表达的抑制作用。 方法： 用lipofectamine2000将编码GFP的质粒pN3-EGFP转入HUVECs中。用G418筛选并维持已转化pN3-EGFP的HUVEC(HUVEC-GFP)。利用T7 RNA转录试剂盒，制备可抑制GFP基因表达的siRNA（GFPsiRNA）和无关对照的RNA（control siRNA）。用oligofectamine将siRNA转入HUVEC-GFP中。继续培养48 h后，检测HUVEC-GFP中GFP蛋白和mRNA表达水平。 结果： 用G418筛选获得了HUVEC-GFP细胞株，可以观察到GFP的稳定表达。HUVEC-GFP转化siRNA后48 h，GFP的荧光强度明显下降，而对照组的荧光强度无明显下降。半定量RT-PCR检测显示，GFPsiRNA对GFP mRNA表达有较强的抑制作用，抑制率达40%，而control siRNA对GFP mRNA表达水平无明显的抑制作用。 结论： 利用体外转录合成的siRNA能有效地抑制HUVECs中GFP的表达。     

灯盏花素对大鼠心室肌细胞瞬间外向和内向整流钾电流的影响

目的：研究灯盏花素对大鼠心室肌细胞膜瞬间外向钾电流（I_to）和内向整流钾电流(I_K1)的影响，在离子通道水平探讨灯盏花素的抗心律失常作用机制。方法： 用急性酶解法获得单个大鼠心室肌细胞，标准的全细胞膜片钳技术记录I_to和I_K1。结果：(1) 灯盏花素呈浓度依赖性抑制I_to，在+50 mV时，0.02、0.05、0.08、0.10 (g· L^-1)灯盏花素分别阻断Ito峰电流(10.07±0.30)%、(27.47±1.25)%、(42.72%±1.30)% 和(56.09±2.10)%，冲洗后可以完全恢复。在+50 mV时，0.10 g·L^-1灯盏花素使峰电流从（29.61±3.40）pA/pF 减少至（13.00±1.80）pA/pF (n=5，P<0.05)。（2）灯盏花素呈电压依赖性抑制I_to，在0～+50 mV,各浓度随电压增加抑制作用明显减弱。（3）0.10 g·L^-1灯盏花素对I_to失活、激活和复活曲线无明显影响。（4）0.10 g·L^-1灯盏花素对I_K1无明显影响。结论： 灯盏花素能够抑制心肌细胞I_to，呈浓度依赖性和电压依赖性，对I_K1无明显影响，这可能是其抗心律失常作用的重要机制之一。     

氧化型低密度脂蛋白诱导巨噬细胞炎症因子表达

目的:探讨氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)对培养的人巨噬细胞表达巨噬细胞移动抑制因子(macrophagemigrationinhibitory factor,MIF)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)mRNA水平的影响.     

在红细胞内期表达的恶性疟原虫锌金属肽酶M1家族的氨基肽酶基因

在疟原虫血红蛋白降解、侵染宿主细胞、抗原处理、裂殖子释放等生物学有关的研究中,蛋白酶是很具吸引力的研究内容。作者用一种抗PF96免疫血清筛选疟原虫表达文库,分离得到一新的锌金属肽酶M1家族的