转染isl1基因促进骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的: Isli蛋白在心脏发生和多能心脏祖细胞分化调节中发挥着重要作用, 本文旨在探寻转染 isl1 基因是否能提高骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化的能力。方法: 利用携带 isl1 基因的慢病毒(LVS- isl1)感染人骨髓间充质干细胞, 通过Puromycin筛选获得稳定细胞株,并对其进行RT-PCR和Western blotting鉴定。以共培养为基础, 用real-time PCR、Western blotting以及免疫荧光法检测Isl1蛋白的心肌诱导能力。结果: RT-PCR和Western blotting表明成功获得稳定细胞株BMSC- isl1, real time-PCR结果显示BMSC- isl1组较之BMSCs组和BMSC-vehicle组GATA 结合蛋白4、NK2转录因子5、肌细胞增强因子2C和兰尼碱受体2的表达量分别提高了2.3、2.7、2.6和3.2倍;Western blotting以及免疫荧光法结果均提示BMSC- isl1 组内心肌肌钙蛋白T、心肌肌钙蛋白I和α-辅肌动蛋白的表达均比BMSCs组和BMSC-vehicle组要高。结论: 转染isl基因的BMSCs不仅可以稳定表达Isli蛋白, 而且在微环境共培养条件下, 可以提高BMSCs向心肌细胞分化的能力。     

miR-1、miR-16和miR-208前体在乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞中的表达

目的检测心肌特异的miR-1、miR-16和miR-208前体在乳小鼠、乳大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞中的表达。方法利用出生1～3d的Sprague-Dawley（SD）大鼠和C57BL/6小鼠,采用2.5%胰酶消化和差速贴壁法分离心肌细胞和心肌成纤维细胞。提取原代的乳小鼠、乳大鼠心肌细胞及P1代的心肌成纤维细胞总RNA,以β-actin为内参照,逆转录酶-聚合酶链式反应（RT-PCR）分别检测miR-1、miR-16和miR-208的前体表达水平。用FluorChem8900软件分析琼脂糖凝胶电泳后PCR产物条带的灰度值,计算出表达的目的miRNA前体与β-actin的比值。结果有效分离并培养了乳C57BL/6小鼠、乳SD大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞。RT-PCR结果显示,在乳SD大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞中miR-1和miR-16均有相近水平的表达;心肌细胞中miR-208的表达显著低于miR-208b（P〈0.01）,miR-208b在心肌细胞中的表达显著高于其在心肌成纤维细胞中的表达（P〈0.05）。乳C57BL/6小鼠心肌细胞中miR-1a-1的表达显著低于miR-1a-2（P〈0.01）,而miR-1a-2在心肌细胞和心肌成纤维细胞中的表达水平一致;miR-16-1在心肌细胞和心肌成纤维细胞中表达水平相近,而miR-16-2在两种细胞中均不表达;心肌细胞中miR-208a和miR-208b表达水平差别不明显,心肌成纤维细胞中只有miR-208a表达,并且在水平上低于其在心肌细胞中的表达（P〈0.05）。结论 miR-1、miR-16和miR-208前体在乳小鼠、乳大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞中呈细胞特异性的表达。     

骨髓干细胞向心肌细胞分化的基因芯片分析

目的:观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)在特殊微环境下向心肌细胞分化的过程中基因表达的差异变化.方法:用密度梯度离心法培养BMSCs,原代培养乳鼠心室肌细胞,与BMSCs一起用半透膜共培养.共培养后2周提取细胞总RNA,进行22K Human Genome Array芯片检测.用RT-PCR检测心肌分化相关的基因的时序表达.结果:基因芯片检测BMSCs诱导前后差异基因的表达水平,发现诱导2周后表达明显升高(ratio>5)的基因有572个,表达下调(ratio<0.2)的基因有336个.基因的时序性表达发现HOP,Nkx2.5和GATA4基因在诱导前几乎没有检测到阳性表达,诱导后0.5周表达增强,1～2周表达达到高峰,维持一定水平后到4～8周表达呈下降趋势.心肌特异性基因β-MHC和ANF在0.5周开始出现,表达随时间逐渐增加,2周达到高峰.结论:分化诱导相关基因如IGF、FGF等的表达与心肌发育分化相关,GATA4和Nkx2.5等转录因子在微环境诱导心肌分化过程中起重要作用.然而心肌的分化实际上极为复杂,转录因子间相互作用的机制尚需进一步探讨.     

阿奇霉素分散片人体药动学和相对生物利用度研究

目的对阿奇霉素血药浓度测定方法进行改进,研究阿奇霉素分散片的相对生物利用度。方法20名男性健康受试者随机交叉双周期给药,分别口服单剂量阿奇霉素试验制剂及参比制剂500 mg后于不同的时间点采血,100μL血样经乙腈沉淀蛋白后,HPLC-MS/MS检测。DAS2.0软件计算两者的药物动力学参数,并评价试验制剂的生物等效性。结果阿奇霉素在1~1 000 ng.mL-1范围内线性好,日内或日间差均小于1 0%,准确度在97%~110%。稳定性良好。萃取回收率至少大于91%。受试药与对照药的药动学参数t1/2,Tmax,Cmax,AUC0~t,AUC0~∞,分别为：（40.3±6.5）h,（2.1±0.7）h,（541.7±179.4）ng.mL-1,（4 772.4±913.9）ng.h.mL-1,（5 346.9±1 300.0）ng.h.mL-1和（35.6±5.1）h,（1.8±0.5）h,（584.9±147.3）ng.mL-1,（5 059.5±1347.4）ng.h.mL-1,（5 480.5±1 484.3）ng.h.mL-1。结果显示：单剂量给药后,阿奇霉素受试制剂的相对生物利用度为（99.4%±28.3%）。结论本方法简单快速,灵敏可靠,成功应用于阿奇霉素生物等效性研究,阿奇霉素试验制剂相对参比制剂生物等效。     

HPLC—MS／MS法检测辛伐他汀血浆浓度及生物等效性研究

目的改进辛伐他汀血药浓度测定方法,研究辛伐他汀的相对生物利用度。方法20名男性健康受试者随机交叉双周期给药,分别口服单剂量辛伐他汀试验制剂及参比制剂40mg后于不同的时间点采血,200μL血样经1mL乙醚1次萃取后,HPLC—MS／MS检测。DAS2．0软件计算两者的药物动力学参数及相对生物利用度,并评价试验制剂的生物等效性。结果辛伐他汀在0．1-20ng·mL^-1线性好,日内或日间差均〈6％．准确度在101％～109％,稳定性良好,萃取回收率≥82％。受试药与对照药的药动学参数t1/2,tmax,Cmax,AUC0-t,AUC0-∞,分别为：（5．3±5．1）h,（2．2±0．7）h,（4．6±3．0）ng·mL^-1,（24．3±15．7）ng·h·mL^-1,（27．5±21．6）ng·h·mL^-1和（4．5±6．7）h,（1．9±0．7）h,（5．0±3．0）ng·mL^-1,（21．4±13．4）ng·h·mL^-1,（23．9±21．2）ng·h·mL^-1。结果显示：单剂量给药后,辛伐他汀受试制剂的相对生物利用度为（113．1％±17．4％）。结论本方法简单,快速,灵敏,成功应用于辛伐他汀生物等效性研究,辛伐他汀试验制剂相对参比制剂生物等效。     

孕期吸烟对SD大鼠胚胎心脏发育的影响

目的探讨孕期吸烟对SD大鼠胚胎心脏发育的影响及分子机制。方法将24只怀孕SD母鼠随机分为4组:正常对照组、10支烟/d组、20支烟/d组、40支烟/d组,每组6只,并于孕期0.5 d(GD 0.5)后开始给予吸烟处理直至分娩。采用超声多普勒Vevo2000检测出生后1 d的新生乳鼠的左心结构及其心脏功能;采用Color-Doppler检测心室血流方向,以确认室间隔的发育是否异常。心功能检测完毕后,收集各组新生乳鼠心脏组织,采用Western-blot检测心肌特异转录因子GATA4的表达量。结果各组新生乳鼠心脏重量无明显差异,40支烟/d处理组乳鼠体重显著下降,与对照组相比,差异有统计学意义(P0.001)。孕期持续给予40支烟/d被动吸烟处理能显著降低左心室重量、左心室舒张/收缩末期前壁厚度和左心室舒张/收缩末期后壁厚度,差异均有统计学意义(P0.05)。孕期给予20支烟/d和40支烟/d处理后,新生乳鼠的GATA4蛋白表达呈剂量依赖性下调,40支烟/d组与对照组相比,差异有统计学意义(P0.05)。结论母鼠在怀孕期间接受被动吸烟后,引发后代新生乳鼠的心功能受损,其机制可能与下调心肌特异转录因子GATA4表达相关。     

用编码βARKct的重组腺病毒阻断Gβγ介导的信号转导途径

目的 :新近研究发现 ,β肾上腺素受体激酶 1(βARK1)羧基端的 195个氨基酸残基 (495Gly - 6 89Leu ,亦称 βARKct)是Gβγ的结合区 ,能特异性的抑制Gβγ的活性 ,阻断Gβγ介导的信号转导途径。用重组腺病毒rAd - βARKct感染去甲肾上腺素 (NE)诱导的体外培养的乳鼠心肌细胞 ,研究编码 βARKct的重组腺病毒对Gβγ介导的心肌肥大过程的阻断作用。 方法 :用分子克隆技术 ,构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack -CMV - βARKct,与腺病毒骨架质粒pAdEasy -I共转化BJ5 183菌 ,采用细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAdTrack -gfp - βA…     

3种恶性疟原虫红内期抗原基因的测序和序列分析

目的 测定我国恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸富集蛋白（GARP），丝氨酸重复抗原（SERA）和裂殖子表面蛋白1（MSA1）基因序列，并进行序列分析。方法：采用PCR技术从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中扩增GARP，SERA和MSA1基因片段，分别插入到测序载体上进行测序。应用DNAstar软件辅助分析3种抗原基因的结构及3种抗原在不同恶性疟原虫株间的分化情况。结果 恶性疟原虫FCC1／HN株GARP基因全长2263bp，编码682个氨基酸残茯，谷氨酸占23．61％，包含5个典型的氨基酸重复序列；SERA基因全长3448bp，编码995个氨基酸残基，丝氨酸含量为10．65％，包含1个连续32个丝氨酸（S）残基的序列；MSA1基因全长5085bp，编码1694个氨基酸残基，MSWA1的氨基酸序列符合MAD20特征。恶性疟原虫FCC1／HN株与3D7，FC27株GWARP的序列差异主要集中于C－末端；FCC1／HN株与FCR3，3D7，FCBR，Hondulas-1株SERA的序列差异主要集中于N－端，FCC1／HN株与MAD2，3D7，HN1，HN2，FC27，RO－71RO－33，CAMP和Palo-alto株MSA1的同源性高，K1和WELLCOME株MSA1的同源性高，各分离株MSA1的序列差异主要处于第2至16分区。结论 了解了恶性疟原虫FCC1／HN株GARP，SERA和MSA1的初级结构及其编码基因结构。恶性疟原虫FCC1／HN株与其它分离株GARP和SERA的氨基酸序列差异集中于特定区段，FCC1／HN株MSA1不同分区的氨基酸序列与其它分离株MSA1的对应序列存在不同程度的差异。     

异丙酚对人心房肌细胞瞬时外向整流钾电流的影响

目的 探讨异丙酚对人心房肌细胞瞬时外向整流钾电流(I_(to))的影响.方法 体外循环下行冠状动脉旁路移植术患者,术中于上腔静脉插管前取下右心耳组织,采用急性两步酶解法消化分离成单个心房肌细胞,室温下进行膜片钳全细胞模式记录I_(to).记录不同浓度(25、50、100、150、200 靘ol/L)异丙酚在+50 mV钳制电压下I_(to)的变化,并记录50μmol/L异丙酚对I_(to)激活、失活、失活后再激活动力学的影响.结果 与给药前相比,50、100、150、200 μmol/L异丙酚呈浓度依赖性地抑制I_(to)峰电流密度(P<0.05).给药前、后半数激活电压和斜率因子、半数失活电压和斜率因子、时间常数比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 异丙酚可呈浓度依赖性地抑制人心房肌细胞I_(to),产生负性肌力作用,可能是其抗心律失常作用的重要机制之一.     

Effect of carvedilol on attenuating the acute myocardial infarction-induced myocardial fibrosis in rats

Carvedilol,nonselective β-adrenoreceptor antagonist,was showed protective effects against acute myocardial infarction(AMI)-induced myocardial injury,however,the mechanisms underlying the antifibrosis effect of carvedilol has not been well known.The aim of the present study was to investigate the potential mechanism for the anti-fibrosis effect of carvedilol against AMI-induced myocardial fibrosis in rats.Methods Male SD rats were randomized into the sham group,LAD surgery-AMI model group,AMI plus low dose of carvedilol treatment group(1 mg /kg per day,CAR-L),AMI plus medium dose of carvedilol treatment group(5 mg /kg per day,CAR-M) and AMI plus high dose of carvedilol treatment group(10 mg /kg per day,CAR-H).The passage 3 neonatal SD rat cardiac fibroblasts were used for hypoxia /normoxia(2 h /4 h) treatment in the presence of carvedilol(0,1,2 and 4 μM).Results Cardiac remodeling and impaired heart function were observed after 14-week LAD surgery treatment,however,and the cardiac remodeling and decreased ejection fraction(EF%) and fractional shortening(FS%) were efficiently rescued in the CAR-M and CAR-H groups.The up-regulated expressions of Col1a1,Col3a1 and α-SMA at mRNA and protein levels were significantly reduced in the CAR-M and CAR-H groups.The in vitro study showed that Col1a1,Col3a1 and αSMA expressions at both mRNA and protein levels were down-regulated by carvedilol in rat cardiac fibroblasts in a dose-dependent manner.Smad3 inhibitors,SIS-3 and naringenin,could efficiently decrease Col1a1,Col3a1 and α-SMA expressions in rat cardiac fibroblasts.Smad3 was shown significantly inactivated in carvedilol-treated rat cardiac fibroblasts.Conclusion Carvedilol negatively regulates Smad3 signal pathway and inhibits extracellular matrix related Col1a1,Col3a1 and α-SMA expressions,contributing to the anti-fibrosis effect of carvedilol against AMI-induced myocardial fibrosis in rats.