miR-21调节缺血缺氧诱导的大鼠肝卵圆细胞自噬的研究

目的探讨miR-21在缺血缺氧诱导的大鼠肝卵圆细胞自噬中的作用。方法体外培养肝卵圆细胞,慢病毒转染肝卵圆细胞构建稳定的细胞株,分别提取各组细胞RNA逆转录后行SYBR Green实时荧光定量PCR,检测各组miR-21的表达,以转染好的稳定的细胞建立缺血缺氧模型,共分为3组:miR-21空载体慢病毒转染HOC自噬组,miR-21增强慢病毒载体转染HOC自噬组,miR-21-inhibition慢病毒载体转染HOC自噬组。Hoechst 33258染色观察细胞凋亡;应用丹(磺)酰戊二胺(Monodansylcadaverine,MDC)染色荧光定位法、观察各组细胞的自噬;免疫印迹法(Western blotting)检测各组细胞LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达情况。结果与空载体组比,增强组miR-21基因水平表达增强,而MDC染色减弱(自噬减少),蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值减少;而抑制组miR-21基因水平表达减少,MDC染色增强(自噬增强),蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增多。结论抑制miR-21过表达可以增强缺血缺氧引起的肝卵圆细胞的自噬,有利于肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境中稳定细胞内环境,维持细胞的存活。     

腺病毒携带人乙型肝炎病毒表面前S2抗体基因转染大鼠移植肝预防乙型肝炎病毒再感染

目的探讨腺病毒携带人乙型肝炎病毒表面前S2抗体基因预防乙型肝炎病毒(HBV)再感染移植肝的作用。方法将人乙型肝炎病毒表面前S2抗原人源化抗体基因(Ab-H-HBV-S2)克隆入5型腺病毒穿梭质粒载体,在293细胞中重组,产生重组型腺病毒。用重组腺病毒感染冷保存时的大鼠供肝,获得人乙型肝炎病毒表面前S2抗体(简称为:前S2抗体)的表达。观察前S2抗体在体外保护人原代肝细胞不受HBV感染的效果。结果用50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定重组腺病毒滴度为5.1×1010PFU/ml。受鼠肝移植后3d时,血清中前S2抗体的表达量为(16.7±10.5)mg/L,7d时的表达量为(30.9±13.6)mg/L。当受鼠血清中前S2抗体浓度≥0.5mg/L时,与HBV和人原代肝细胞共同培养后,检测上清液中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)为阴性。结论全长Ab-H-HBV-S2基因克隆入腺病毒载体,感染大鼠供肝,获得人源化抗体的表达;表达的前S2抗体能保护人原代肝细胞不受HBV感染。     

血管生成素样蛋白3的表达及其与肝细胞癌侵袭和生长的关系研究

目的了解血管生成素样蛋白3（ANGPTL3）mRNA在肝细胞癌（HCC）和癌周组织的表达,探讨ANGPTL3和HCC侵袭和转移的关系,为分子水平干预肿瘤血管生成,预防HCC复发和转移打下基础.方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测方法,对45例HCC手术标本的癌和癌周组织中ANGPTL3mRNA表达水平进行了相对定量分析.结果肿瘤组织中ANGPTL3mRNA的表达率93.3%（42/45）,癌周组织中表达率77.8%（35/45）,两者无显著差异（P＞0.05）.但肝癌组织中ANGPTL3mRNA的表达强度明显高于癌周组织.ANGPTL3mRNA的表达和肿瘤的新生血管生成,癌栓的形成和肿瘤分级相关,而和肿瘤大小,包膜的完整性无明显相关.结论ANGPTL3在HCC的侵袭和转移中发挥重要作用,促进肿瘤血管形成及HCC的侵袭和转移关系密切.     

自噬对肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境中增殖的影响

目的观察自噬对肝卵圆细(hepatic oval cell,HOC)在缺血缺氧微环境中增殖的影响。方法体外培养肝卵圆细胞建立缺血缺氧模型,检测缺血缺氧0、2、4、8和24 h的自噬情况,每个时间点设置单纯缺血缺氧组(ischemia-hypoxia),缺血缺氧+氯喹组(ischemia-hypoxia+CQ),正常对照组(control)。以CCK-8法检测各组HOC增殖能力的变化;Hoechst 33258染色观察细胞凋亡;应用丹(磺)酰戊二胺(Monodansylcadaverine,MDC)染色荧光定位法、免疫荧光细胞化学染色法观察各组细胞的自噬,免疫印迹法(Western blotting)检测各组细胞LC3-II/I蛋白表达情况。结果缺血缺氧对肝卵圆细胞的增殖有抑制作用,且缺血缺氧时间越长抑制越明显。与对照组相比,随着缺血缺氧的时间的延长,MDC染色阳性细胞数,细胞免疫荧光强度和自噬特异标记分子LC3 II水平及LC3-II与LC3-I的比值显著增加(P0.05)。加入自噬抑制剂CQ后肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境中的存活率与未加CQ比较显著下降(P0.05)。结论缺血缺氧可以抑制肝卵圆细胞增殖,并且可诱导肝卵圆细胞自噬;自噬有利于肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境中稳定细胞内环境,维持细胞的存活。     

肝星状细胞对VEGF介导的脂肪间充质干细胞向内皮细胞分化的影响

目的通过大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)与大鼠脂肪间充质干细胞(rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,r ADSCs)在内皮细胞分化诱导培养基中的共培养,观察HSCs对r ADSCs向内皮细胞(endothelial cells,ECs)分化的影响。方法共培养实验设置四组,阳性对照组、实验组、阴性对照组和空白对照组。诱导培养2周后,观察检测各组r ADSCs向ECs的分化情况。结果诱导2周后,三组r ADSCs细胞体积逐渐变小变圆,部分细胞出现典型的内皮细胞鹅卵石样改变;四组细胞v WF、VE-Cadherin和表达均阳性;Western blotting检测结果与免疫荧光结果一致,实验组e NOS蛋白表达明显高于阴性对照组和空白对照组(P0.05);内皮细胞迁移试验显示,实验组每视野下细胞迁移数目明显高于阴性对照组和空白对照组(P0.01);低密度脂蛋白吞噬试验显示,实验组细胞吞噬Di IAc-LDL的能力明显高于空白对照组(P0.05);体外成血管试验显示实验组细胞体外成血管的能力明显高于其他三组细胞—阳性对照组(P0.05)、阴性对照组和空白对照组(P0.01)。结论 HSCs与r ADSCs的间接共培养可以促进大鼠血管内皮细胞生长因子(rat vascular endothelial growth factor,r VEGF)介导的r ADSCs向ECs的分化,并增强分化后ECs的功能。利用共培养体系对多种细胞共培养时进行生长分化现象的观察及其相互影响机制的研究,可以为组织工程功能性血管化组织器官及其生物模拟物的设计和创造提供更加可靠的理论指导和更加广阔的研究策略。     

肝癌复发和转移的分子生物学研究

肝癌复发和转移一直是影响肝癌治疗效果的重要因素,肝癌的复发和转移有一系列基因参与调控,它涉及到细胞基因改变,表面结构、抗原性、侵袭力、粘附能力、产生局部血凝因子或血管生成的能力、分泌代谢功能以及肿瘤细胞与宿主、肿瘤细胞与间质之间相互关系的多步骤、多因素参与的过程。     

不同代次大鼠骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin信号通路表达分析

目的观察不同代次大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外增殖能力及其纤维分化倾向,为临床治疗及组织工程种子细胞的选择提供依据。方法采用贴壁培养法分离培养大鼠MSCs,流式细胞术鉴定细胞表面标记; MTT法检测不同代次MSCs的增殖情况;蛋白质印迹法(Western Blot)检测MSCs Wnt通路相关蛋白的表达情况;实时聚合酶链式反应(Realtime-PCR)法检测不同代次MSCs中成纤维细胞分子标记表达。结果流式细胞术鉴定结果证实我们培养的大鼠MSCs符合间充质干细胞的特征,且纯度高; MTT法检测显示P3代之后细胞的增殖能力明显高于P1、P2代,Western Blot检测显示细胞内Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达随培养代次增强,Realtime-PCR法检测结果证实P9代细胞开始出现成纤维分化倾向。结论 MSCs作为种子细胞不宜超过P9代,P3～P7代具有纯度高、倍增快等优点,是能够满足组织工程细胞植入的种子细胞。