小鼠Egr-1启动子的克隆及其辐射诱导特性的研究

目的：扩增Egr-1启动子并构建Egr-PGL重组质粒,探讨不同剂量X射线诱导被转染的NIH3T3细胞荧光素酶表达活性。方法：并利用PCR方法扩增Egr-1p与PGL3-E表达载体连接,用发光仪测定荧光素酶与底物反应的发光值,分析X射线诱导荧光素酶表达。结果：对PCR产物进行测序,序列基本正确;电泳检测重组质粒,有正确的特异性片段;重组质粒转染小鼠NIH3T3细胞鉴定Egr-1p的辐射调节特性,发现照射组发光值均高于假照组,75mGy照射组的表达量约为假照组的5倍,2、4、6、8和10Gy照射组的表达量分别约为假照组的5～7．5倍。结论：扩增得到的Egr-1启动子在不同剂量X射线照射下均具有诱导下游基因表达增强作用;低剂量照射诱导Egr-1启动子下游基因表达增强作用的发现可能在肿瘤基因治疗中更具有实用价值。     

碱性成纤维细胞生长因子对辐射诱导的小鼠胸腺细胞凋亡的抑制作用

碱性成纤维细胞生长因子 (ｂＦＧＦ)作为一种多肽类生长因子 ,有着广泛的生理功能。对中胚层和神经外胚层来源的细胞具有促有丝分裂的作用 ,在胚胎发育和组织分化中 ,是形态形成、促细胞分裂和诱导细胞分化不可缺少的因子[1 ] 。近年来 ,许多实验结果表明体外许多因素 ,如化学药物、细胞因子、辐射等都可诱导细胞凋亡[2 ] 。本研究ｂＦＧＦ对辐射诱导的免疫系统胸腺细胞凋亡的调节作用 ,旨在从一个侧面探讨ｂＦＧＦ作用于免疫系统的机理及其在辐射防护中的意义。一、材料和方法1 ｂＦＧＦ :由暨南大学生物工程研究所提供。2 动物照射 :昆明…     

pcEgr-IFNγ基因治疗联合放射治疗抗肿瘤作用的实验研究

目的：探讨pcEgr-IFNγ基因－放射联合治疗对修黑色素瘤B16小鼠的抗肿瘤作用及其免疫学机理。方法：肿瘤局部注射脂质体包裹的pcEgr-IFNγ重组质粒后36h,接受20GyX射线照射,观察放疗后不同时间肿瘤大小,放疗后3d瘤内IFNγ转录水平和15d部分免疫学指标。结果pcEgr-IFNγ基因－放射联合治疗后第3－15天,肿瘤生长速率明显低于单纯照射组,照第第9－15天明显低于单纯基因治疗组和空质料对照组;治疗后第3天,pcEgr-IFNγ基因－放射联合治疗组瘤内IFNγ表达水平明显高于单纯基因治疗组;脾脏NK毒胞毒活性、IL－2和IFNγ分泌活性均明显高于单纯放疗组和单纯基因治疗组。结论：pcEgr-IFNγ基因－放射联合治疗抗肿瘤作用明显优于单纯放疗和单纯基因治疗组,其机理可能与放疗诱导瘤内IFNγ基因表达增强,激活荷瘤机体抗肿瘤免疫功能有关。     

电离辐射对脾细胞p16、CyclinD、CDK4基因表达的影响

目的 研究X射线全身照射对小鼠脾细胞p16、CyclinD、CDK4基因转录及蛋白表达的影响。方法 采用Northern blot方法检测了2Gy X射线照射后p16、CDK4基因转录变化,半定量RT-PCR方法检测CyclinD mRNA水平,采用流式细胞术(FCM)检测三者蛋白表达变化。结果 研究证实,2Gy X射线全身照射后2~8 h脾细胞p16 mRNA水平明显增高,12 h恢复正常水平。p16蛋白表达于照射后24 h明显增高(P <0.05)。周期蛋白CyclinD mRNA水平轻度降低,其蛋白表达未见明显改变。照射后2 h,脾细胞CDK4 mRNA水平开始降低,持续到72 h,降至最低值,为假照射组的55.9%。照射后8~72 h,CDK4蛋白表达明显减少(P <0.05~P <0.01)。结论 电离辐射照射后脾细胞内p16基因表达增高;CDK4基因表达降低。     

电离辐射诱导免疫细胞旁效应的实验研究

目的 探讨不同剂量电离辐射在体外诱导免疫细胞的旁效应。方法用^3H-TdR掺入法观察未受照射的EL4细胞的增殖效应，用硝酸盐还原法测定受照射的J774A．1细胞分泌一氧化氮(NO)的含量。结果在受高、低剂量照射的抗原递呈细胞(J774A．1)和未受照射的T淋巴细胞(EL4)的共培养体系中，0．075Gy X射线照射的J774A．1细胞使EL4细胞的增殖增强，而2Gy X射线照射的J774A．1细胞则使EL4细胞的增殖抑制；较大剂量X射线照射后J774A．1细胞分泌NO量明显增多，可能影响共培养的T细胞的增殖反应。结论低剂量辐射可诱导兴奋性或有益的旁效应，其机理有待进一步阐明。     

2 Gy X射线对EL-4细胞p16、CyclinD、CDK4基因转录和蛋白表达影响

目的研究电离辐射对EL-4细胞p16、CyclinD、CDK4基因转录及蛋白表达的影响.探讨p16/CyclinD/CDK4负向调控通路在辐射诱导G1期阻滞中的作用.方法采用半定量RT-PCR方法检测2 GyX射线照射后EL-4细胞p16 mRNA水平变化,采用Northern blot方法检测CyclinD、CDK4基因转录变化,应用免疫细胞化学方法(ICC)检测3种蛋白表达的变化.结果2 Gy X射线照射后2～48 h EL-4细胞p16 mRNA水平增高,48 h恢复至正常水平.p16蛋白表达照射后2h开始增高,12h达到峰值(P＜0.01),72 h恢复至正常水平.EL-4细胞周期蛋白CyclinD mRNA水平于照射后1 h开始明显降低,照射后8 h降至最低值.CyclinD蛋白表达于照射后8 h开始明显减少,持续至照射后48 h(P＜0.05～P＜0.01).EL-4细胞CDK4 mRNA水平于照射后1h明显降低,照射后4 h～12 h保持较低水平,72 h恢复至正常水平.CDK4蛋白表达于照射后4 h明显下降,12 h降至最低,72 h仍低于正常水平(P＜0.01).结论2 Gy X射线照射可诱导EL-4细胞p16表达增高,CyclinD和CDK4表达降低.提示p16/CyclinD/CDK4负向调控通路可能在电离辐射诱导EL-4细胞G1期阻滞中发挥重要作用.     

75mGyX射线诱导小鼠胸腺细胞转录因子CREB、NF—kB及AP1水平变化

目的：为了解低剂量x射线全身照射对小鼠胸腺细胞基因转录调控的影响。方法：采用凝胶电泳迁移率变化分析和寡核苷酸竞争抑制方法检测低剂量x射线对小鼠胸腺细胞基因转录调控的影响。结果：迁移率变化证实75mGyX射线全身照射小鼠后4h，胸腺细胞核蛋白提取物的转录因子CREB及NF-kB与其基因启动部位增强子控制序列的结合活性分别增强6倍及4．3倍，AP1增强2倍。竞争抑制试验证实CREB及NF-kB与其控制序列特异地结合。结论：低剂量X射线全身照射选择性地激活胸腺细胞CREB、NF-kB及AP1，通过与增强子控制序列位点的结合．特异地诱导基因转录。     

VEGF基因治疗靶向载体的构建及其特异性表达分析

目的 :构建KDR启动子介导的VEGF逆转录病毒载体pLXSN D2 99 KDRp VEGF1 6 5,并对其内皮细胞特异性表达作用进行分析。方法 :将逆转录病毒载体 3’LTR的U3区缺失 2 99个碱基使其自身启动子失活 ,然后重组pLXSN D2 99 KDRp VEGF1 6 5载体。经PA317细胞包装 ,NIH3T3细胞测定其病毒滴度。用高病毒滴度细胞株产生的病毒上清分别感染ECV30 4人脐静脉血管内皮细胞和NIH3T3细胞 ,收集细胞培养上清经ELISA和westernBlot分析。结果 :VEGF1 6 5在内皮细胞ECV30 4中的表达量明显高于NIH3T3细胞。结论 :构建的pLXSN D2 99 KDRp VEGF载体 ,可在内皮组织细胞中特异性地表达VEGF。     

小鼠白细胞介素12基因的钓取及其在COS-7细胞中的表达

目的：钓取小鼠白细胞介素12(mIL-12)p40和p35cDNA并检测其在哺乳动物细胞(COS-7)中的表达。方法：RT—PCR法从小鼠腹腔巨噬细胞mRNA中扩增p40和p35亚基；脂质体Lipofec—tAMINE将质粒pNG—mIL-12转染至COS-7细胞，ELISA法检测不同时间mIL-12表达水平。结果：①RT—PCR法扩增出特异的p40和p35亚基，p35亚基克隆至pKS栽体测序；②ELISA法检测转染pNG—mIL-12的COS-7细胞上清有mIL-12分泌。结论：为进一步研究mIL-12的免疫调节机制及其抑瘤作用奠定了基础。