抗人肺癌单克隆抗体的制备及初步鉴定

以人肺癌细胞株GLC作为抗原，免疫BALB／C小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合。经克隆筛选获得两株分泌抗人肺癌单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株，并对其McAb特异性进行了初步鉴定。1材料和方法1.1动物和细胞系BALB／C小鼠由同济医院动物中心提供；SP2／0、SMC7721、BGC均为本室冻存细胞；GLC由中国科学院肿瘤所提供。1.2免疫过程人肺腺癌细胞系GLC培养在含20％小牛血清的RPMI1640完全培养液中，取对数生长期细胞调整细胞浓度为1×10~7细胞／ml，BALB／C小鼠腹腔注射1ml，间隔2周加强注射1次，于融合前3d每天加强免疫1…     

Study on Lymphocyte Activation and Proliferation Induced by Anti-CD3 McAb

ＳｔｕｄｙｏｎＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＡｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＩｎｄｕｃｅｄｂｙＡｎｔｉ－ＣＤ３ＭｃＡｂＬＩＭｉｎｇ（李鸣）；ＹＡＮＧＪｉｎｇ（杨敬）；ＳＨＥＮＧｕａｎ－ｘｉｎ（沈关心）（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＩｍｍｕｎｏｌ...     

热休克蛋白90抑制乙型肝炎病毒复制的初步研究

目的 了解热休克蛋白90 (HSP90)对HBV复制的影响并探讨其可能的分子机制. 方法 构建人HSP90真核表达质粒pXF3H-HSP90 (HA-HSP90),与HBV复制型质粒HBV1.3共转HepG2细胞,ELISA检测细胞上清液HBsAg表达水平,Southern blot检测HBV复制中间体的表达.将HA-HSP90表达质粒或HSP90 siRNA转染HepG2细胞,实时定量逆转录聚合酶链反应检测白细胞介素(IL)-1β、IL-6以及干扰素应答基因1(IFIT1)的表达.将TANK结合激酶1(TBK1)siRNA、HBV1.3、HA-HSP90共染HepG2细胞,Southern blot检测HBV复制中间体的表达.多组间数据比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验. 结果 成功构建了表达HSP90的真核表达质粒HA-HSP90.转染HA-HSP90的HepG2细胞内高水平表达外源蛋白,而未转染质粒的细胞内没有检测到外源蛋白的表达.转染HA-HSP90质粒组细胞上清液中的HBsAg表达量吸光度值为0.124±0.033,明显低于转染空载体pXF3H组的0.340±0.011及未转染组的0.615±0.069(F=61.013,P＜0.05).过表达HSP90也能抑制HBV复制,转染HA-HSP90组、转染空载体pXF3H组与未转染组HBV复制中间体表达量吸光度值分别为108.92±8.59、872.45±13.00和7856.37±60.23,差异有统计学意义(F=28260.00,P＜0.05).在HepG2细胞内高表达HSP90能诱导高水平的IFIT1产生,其中HA-HSP90组与空载体对照pXF3H组IFIT1表达的2-△△CT值分别为82.139±0.919和5.579±0.644,差异有统计学意义(F=13.108,P＜0.05),但未检测到IL-1 p与IL-6的诱导表达.下调HepG2细胞中干扰素信号通路分子TBK1不影响HSP90对HBV的抑制,其中HSP90组与siTBK1+ HSP90组HBV复制中间体条带灰度值分别为1952.64±67.88和2366.64±71.16 (F=31.30,P＞0.05). 结论 HSP90能够抑制HBV的复制与蛋白表达,这种抑制作用不依赖于TBK1通路,也与IL-1β信号通路无关.     

生物信息模拟及生物学效应结合研究盐酸小檗碱对乙酰胆碱酯酶的抑制作用

目的 体外研究盐酸小檗碱对乙酰胆碱酯酶(AchE)活性的抑制作用.方法 利用生物信息模拟技术,体外模拟以盐酸小檗碱为代表的5种生物碱(配体)与AchE(受体)相互分子对接效应与差异性;将小鼠眼眶取血后脱臼处死,立刻开腹取出十二指肠制备组织匀浆,采用双缩脲法测定肠组织匀浆中总蛋白含量,将盐酸小檗碱与肠组织液共孵育后用酶法检测小鼠十二指肠组织和血清中AchE活性,以生物信息模拟和生物学效应相结合对比研究盐酸小檗碱对AchE的抑制作用.结果 体外分子模拟5种生物碱中只有盐酸小檗碱和药根碱能与AchE受体活性中心进行分子对接;盐酸小檗碱能明显抑制小鼠十二指肠组织和血清中AchE活性,抑制程度与其浓度具有明显的量效关系.结论 体外生物信息模拟和生物学效应研究均表明盐酸小檗碱对AchE有明显的抑制作用.     

表达HBsAg特异性siRNA的重组腺相关病毒载体的构建

目的构建表达针对HBsAg小发卡RNA(shRNA)的重组腺相关病毒载体,以观察该病毒在体外对HBsAg和HBeAg的抑制作用。方法将表达针对HBsAg的shRNA定向克隆到pAAV/U6-hrGFP质粒中,获得重组表达质粒(pAAV-shHBs-hrGFP);采用磷酸钙转染法将该质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共同转染AAV293细胞,进行rAAV-shHBs-hrGFP重组病毒包装。收获病毒感染HepG2.215细胞;采用ELISA法检测HBsAg和HBeAg水平。结果酶切鉴定、测序结果表明,pAAV-shHBs-hrGFP载体成功构建。包装收获的rAAV-shHBs-hrGFP病毒液可以感染HepG2.215细胞,并且可以抑制HBsAg和HBeAg的表达。结论制备的rAAV-shHBs-hrGFP病毒载体能够抑制HBV在体外的抗原表达。     

15种变异体乙型肝炎表面抗原的抗原性

HBV s基因突变可引起HBsAg氨基酸变异，并导致抗原性改变。流行病学研究表明其最常见的变异位点是Gly145Arg。此位点的变异株可以逃避乙型肝炎疫苗的免疫预防，而且用目前针对野生株“a”决定簇的单克隆抗体制备的诊断试剂不能测及，造成漏检。我们选8种HBsAg诊断试剂及5种华中科技大学同济医学院附属同济医院临床免疫研究室制备的抗-HBs单克隆抗体检测15种HBsAg变异体的抗原性，了解不同变异体对其抗原性的影响。     

乙型肝炎表面抗原主要亲水区Ⅱ的抗原性

目的研究HBsAg主要亲水区Ⅱ的4个氨基酸变异对HBsAg抗原性的影响。方法定点突变HBsAg主要亲水区Ⅱ的4个氨基酸对应的s基因(P120T、C12lS、K1221和T123N),构建4个真核表达重组质粒。用重组质粒和表达G145R HBsAg质粒体外瞬时转染HepG2细胞。4种抗体和7种国产HBsAg ELISA诊断试剂盒检测转染细胞上清液和细胞裂解液中变异HBsAg的免疫反应性;免疫荧光检测单克隆抗体与转染细胞内变异HBsAg的免疫反应性。结果成功构建了表达HBsAg主要亲水区Ⅱ的4个氨基酸变异的重组质粒,P120T、C121S、K122I和T123N变异HBsAg的免疫反应性比野生HBsAg低,T123N变异导致HBsAg存在分泌障碍。结论HBsAg主要亲水区Ⅱ的4个氨基酸对维持HBsAg的空间构象和抗原性具有重要作用。     

热休克蛋白90抑制剂17-AAG对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

目的探讨热休克蛋白90(HSP90)是否参与肝细胞转化生长因子(TGF)β信号通路的活化,以及HSP90对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。方法 HSP90抑制剂17-AAG作用HepG2细胞,提取细胞总RNA,实时定量RT-PCR检测TGFβ下游信号分子PAI-1的表达。HepG2细胞用17-AAG预处理2 h,同时用TGFβ或TβR抑制剂SB431542作用后,将HBV复制型质粒HBV1.3转染细胞,第4 d提取HBV核心颗粒,Southern Blot检测HBV复制中间体,ELISA检测上清HBsAg的表达。结果 17-AAG能够下调HepG2细胞PAI-1的表达,HepG2细胞内HBV复制中间体表达水平明显降低,HBsAg的表达亦受到抑制,但上调或阻断TGFβ信号通路对HBV复制影响不明显。结论 HSP90参与肝细胞内TGFβ信号通路的活化,其抑制剂17-AAG能够抑制HBV的复制与蛋白表达,但该抑制作用与TGFβ信号通路活化无关。     

高亲和力抗乙型肝炎表面抗原单克隆抗体制备及检测变异HBsAg方法的建立

目的制备抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)单克隆抗体,建立检测变异HBsAg的方法。方法用血源HB-sAg免疫BALB/c小鼠,制备可以识别变异HBsAg的抗-HBs单抗。筛选出可以较好识别变异HBsAg的单抗mAb1,优化该抗体ELISA检测HBsAg的方法,与2种HBsAg检测试剂比较检测变异HBsAg的能力。对6份临床样品进行检测及序列分析,以证实方法的可靠性。结果经过筛选,得到1种可以较好识别包括G145R在内的大多数变异HB-sAg的单抗。检测变异HBsAg的能力优于市售HBsAg诊断试剂。结论制备的单抗可以用于ELISA检测变异HB-sAg,减少HBsAg变异株的漏检率。