功能化多壁碳纳米管对血管内皮细胞毒性的初步研究

目的:由于碳纳米管的广泛应用,其对人类及环境造成的影响日益受到人们的关注.血管是碳纳米管进入人体的首要通道之一,因此探讨功能化与原始状态的多壁碳纳米管对血管内皮细胞的细胞毒性作用具有重要意义.方法:自人脐静脉分离血管内皮细胞,免疫组化进行细胞鉴定.选择0.5～1 μm经羧基修饰的功能化多壁碳纳米管(f-CNTs)与同等长度未经修饰的多壁碳纳米管(p-CNTs)制备颗粒悬液,与血管内皮细胞共育后,利用噻唑蓝实验(MTT比色法)检测细胞活力,透射电镜进行细胞形态学观察;制备碳纳米管透析液,通过MTT实验检测其对细胞的毒性作用.结果:①2种纳米管均对原代脐静脉内皮细胞(HUVEC)产生一定的毒性作用,而且其细胞毒性随剂量递增呈上升趋势.与细胞共育24 h后,p-CNTs的毒性大于f-CNTs;而共育48 h及72 h后,f-CNTs毒性大于p-CNTs.②透射电镜实验表明,f-CNTs共育细胞内空腔明显多于p-CNTs,而空腔内f-CNTs聚集体紧密程度明显小于p-CNTs.③对2种多壁碳纳米管透析后的细胞培养基对细胞活力无明显影响.结论:根据上述结果笔者推测.p-CNTs细胞毒性的主导因素是聚集程度,f-CNTs对细胞毒性的主导因素为表面效应.进入细胞的碳纳米管数目增多,造成细胞损伤或阻断细胞内代谢通路,可能是共育后期f-CNTs细胞毒性大于p-CNTs的原因.     

生物材料诱发血栓形成机制的研究进展

本文对生物材料诱发血栓的机制进行了综述。着重介绍了材料通过影响血管内皮细胞、组织因子、血小板、基质蛋白和细胞因子等几方面进而引发血栓形成的机制，并对将来生物材料血液相容性的研究方法和从分子水平上设计新型生物材料进行了展望。     

LHRH-MPG△NLS/siRNA纳米复合物的制备及稳定性观察

目的设计并合成新型小干扰RNA(siRNA)载体促黄体激素释放激素-MPG△NLS(LHRH-MPG△NLS),考察不同N/P情况下LHRH-MPG△NLS与siRNA结合情况并探索稳定的LHRH-MPG△NLS/siRNA复合物的制备方法。方法将LHRH-MPG△NLS与针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的siRNA按N/P比为4∶1、6∶1、10∶1、12∶1的比例通过静电作用结合,制备多肽/siRNA复合物,并用琼脂糖凝胶电泳检测多肽与siRNA的结合情况。分别在pH值为7.0、7.5、8.0、8.5的溶液中制备N/P为20∶1的多肽/siRNA复合物,另在pH为7.0时按N/P为10∶1、15∶1、20∶1制备多肽/siRNA复合物,BI-9000AT激光光散射仪分别检测其16 d和20 d内粒径大小变化情况,考察其稳定性。结果LHRH-MPG△NLS与siRNA在N/P大于10∶1时形成完全结合的复合物,即siRNA被多肽完全包裹。不同pH值溶液中形成的多肽/siRNA复合物稳定性没有明显的差别,且粒径均在100~280 nm,16 d内未发生明显聚集。在pH为7.0时按N/P比为10∶1、15∶1、20∶1制备的LHRH-MPG△NLS/siRNA复合物在20 d内粒径在150～450 nm分布,且未发生明显聚集,较为稳定。结论实验研究设计了一种新型siRNA载体LHRH-MPG△NLS,当N/P大于10∶1时其可将siRNA完全包裹;pH为7.0时N/P为10∶1、15∶1、20∶1时该载体与siRNA均可形成稳定的纳米级复合物,其中N/P为15∶1和20∶1的复合物粒径稳定性优于N/P为10∶1的复合物;在pH 7.0～8.5的溶液中形成的LHRH-MPG△NLS/siRNA复合物均较稳定,没有明显差异。     

人脐带内皮祖细胞的分离、鉴定及转染EGFP质粒的实验研究

目的 从脐带中分离内皮祖细胞(EPCs),考察其体外增殖、基因转染绿色荧光蛋白质粒的行为.方法 以酶消化法从脐带中分离出内皮祖细胞,并通过流式细胞仪和共聚焦显微镜对内皮祖细胞进行鉴定,以Lipofectamine 2000为转染试剂考察了内皮祖细胞转染绿色荧光蛋白质粒的行为.结果 从脐带中分离培养的内皮祖细胞在第9天形成了典型的内皮细胞集落,流式细胞仪分析结果显示CD133和激酶插入区受体(KDR)的含量均有所提高,并具有内皮祖细胞结合异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荆豆凝聚素1(FITC-UEA-1)和吞噬DiI标记的低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)的功能,能较好地表达绿色荧光蛋白.结论 从脐带中分离的内皮祖细胞体外在适当的培养条件下,可增殖、诱导分化为内皮细胞,并能较好地表达外源基因,是基因与细胞治疗理想的载体.     

功能化修饰多壁碳纳米管对人外周血单个核细胞的毒性研究

目的 探讨不同功能化修饰的多壁碳纳米管(F-MWCNTs)对人外周血单个核细胞(PBMC)的细胞毒性的影响.方法 利用透射电镜表征5种直径和长度均相同的MWCNTs(羟基、羧基、氨基、镀镍修饰和未修饰的MWCNTs(P-MWCNTs))在生理盐水溶液中的分散性.体外实验中先通过Ficoll密度梯度离心从人外周血中分离出PBMC,再将5种MWCNTs分别超声分散于含血清的培养基中,与PBMC共培养12、24、48、72 h,通过CCK-8试剂盒检测5种MWCNTs对PBMC的细胞毒性.结果 5种MWCNTs的分散性相对良好,尤其是各F-MWCNTs.细胞毒性实验结果 表明,MWCNTs的细胞毒性呈剂量-效应关系和一定的时间-效应关系.F-MWCNTs与P-MWCNTs相比,细胞毒性发生显著变化,其中羟基、羧基和氨基修饰的MWCNTs的细胞毒性减小,尤以氨基修饰的细胞毒性减小最为显著(P＜0.05);而镀镍修饰的MWCNTs的细胞毒性反而明显增大,其处理细胞24 h和48 h时的细胞存活率较同剂量(25 μg/ml)的P-MWCNTs均有所降低,差异均有统计学意义(P＜O.01,P＜0.05).结论 功能化修饰不仅影响MWCNTs在水溶液中的分散性,还影响MWCNTs对人外周血淋巴细胞的细胞毒性.     

药物涂层支架的研究进展

冠状动脉粥样硬化是导致人类因心脏病死亡的最主要原因，经皮冠状动脉成形术是其主要治疗手段，但是术后再狭窄的发病率高达10％-60％，目前大量研究表明，药物涂层支架能显著降低经皮冠状动脉成形术后再狭窄率，具有广阔的应用前景。就药物涂层支架的最新进展做一综述。     

壳聚糖载基因纳米粒子的研究

以壳聚糖为基质研究载基因纳米粒子的制备及其对血管平滑肌细胞的转染效率。制备载绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescen t prote in,EGFP)和组织因子途径抑制因子(T issue factor pathw ay inh ib itor,TFP I)质粒DNA的壳聚糖纳米粒子,透射电镜观察两种纳米粒子皆呈球形,光子相关色谱仪(PCS)测定显示纳米粒子的平均粒径为149 nm,粒径分布在80~250 nm之间;载基因纳米粒子的DNA包埋效率和DNA含量分别为96%±1.38%和37%±3.0%。载基因壳聚糖纳米粒子可以有效地保护DNA,防止核酸酶对其的降解作用。血管平滑肌细胞转染实验表明,纳米粒子对细胞基本无毒性,其转染效率与阳离子脂质体转染试剂L ipofectAM INETM相近。     

非病毒型基因载体的生物安全性

近年来,基因载体的生物安全性越来越受到人们的关注,本文介绍了近年来非病毒型基因载体生物安全性的研究进展,综述了非病毒型基因载体的毒性、纳米效应、血液相容性以及免疫反应等方面的研究成果.     

功能化多壁碳纳米管对血管内皮细胞毒性的初步研究

目的由于碳纳米管的广泛应用,其对人类及环境造成的影响日益受到人们的关注。血管是碳纳米管进人人体的首要通道之一,因此探讨功能化与原始状态的多壁碳纳米管对血管内皮细胞的细胞毒性作用具有重要意义。方法自人脐静脉分离血管内皮细胞,免疫组化进行细胞鉴定。选择0．5～1μm经羧基修饰的功能化多壁碳纳米管（f-CNTs）与同等长度未经修饰的多壁碳纳米管（p-CNTs）制备颗粒悬液,与血管内皮细胞共育后,利用噻唑蓝实验（MTT比色法）检测细胞活力,透射电镜进行细胞形态学观察;制备碳纳米管透析液,通过MTT实验检测其对细胞的毒性作用。结果①2种纳米管均对原代脐静脉内皮细胞（HUVEC）产生一定的毒性作用,而且其细胞毒性随剂量递增呈上升趋势。与细胞共育24h后,p-CNTs的毒性大于f-CNTs;而共育48h及72h后,f-CNTs毒性大于p-CNTs。②透射电镜实验表明,f-CNTs共育细胞内空腔明显多于p-CNTs,而空腔内f-CNTs聚集体紧密程度明显小于p-CNTs。③对2种多壁碳纳米管透析后的细胞培养基对细胞活力无明显影响。结论根据上述结果笔者推测,p-CNTs细胞毒性的主导因素是聚集程度,f-CNTs对细胞毒性的主导因素为表面效应。进入细胞的碳纳米管数目增多,造成细胞损伤或阻断细胞内代谢通路,可能是共育后期f-CNTs细胞毒性大于p-CNTs的原因。     

转染TFPI基因对人前列腺平滑肌细胞增殖的影响

目的良性前列腺增生（BPH）是严重危害老年男性健康的常见疾病,本研究旨在研究组织因子途径抑制因子（TFPI）基因对前列腺平滑肌细胞生长的影响,为良性前列腺增生的基因治疗提供参考依据。方法取前列腺增生患者手术切除的前列腺组织,采用酶消化法分离前列腺平滑肌细胞;免疫组化方法进行细胞鉴定;pIRES—TFPI基因转染前列腺平滑肌细胞,以pIRES基因作为基因转染阴性对照;用细胞计数法和四氮唑蓝MTT法观察细胞增殖情况;采用RT-PCR检测细胞内TFPI基因的表达情况。结果SMA免疫组化染色和MASSON染色显示：经过5次传代后,前列腺平滑肌细胞的纯度达到95％以上;TFPI基因转染后,前列腺平滑肌细胞内的TFPImRNA水平明显提高,是未转染组的7倍、阴性对照基因转染组的3．5倍;基因转染4d后,TFPI基因转染组的前列腺平滑肌细胞数明显低于阴性对照基因转染组。结论提示TFPI基因对前列腺平滑肌细胞的增殖具有调控作用,有必要对其作用机理进行进一步研究。