牛血红蛋白分子印迹聚硅氧烷的吸附和释放性能

目的 制备对牛血红蛋白(HB)具有选择性吸附及缓释能力的生物材料.方法 以HB作为模版分子,以硅烷为功能单体,海藻酸钙水凝胶膜为载体合成HB分子印迹聚硅氧烷(MIP),同时不加模板HB制备非印迹聚硅氧烷(NIP),并研究其对HB的吸附和释放性能.结果 MIP对HB的重吸附能力明显强于NIP,并能选择性识别混合蛋白质中的模版蛋白质分子,同时在磷酸盐缓冲液(PBS)和Tris-HCl缓冲液中MIP对HB均具有很好的缓释能力.结论 通过分子印迹技术可制备对目标蛋白质具有选择性吸附及缓释能力的生物材料.     

双顺反子表达人组织因子途径抑制因子和绿色荧光蛋白重组病毒的构建及其在内皮祖细胞中表达

目的 构建双顺反子表达人组织因子途径抑制因子(TFPI)与绿色荧光蛋白(GFP)的逆转录病毒表达载体pMSCV-TFPI-IRES-GFP,并观察其在大鼠内皮祖细胞(EPCs)中的表达,为进一步研究TEPI在预防血管再狭窄中的作用奠定基础.方法 将人全长TFPI cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pMSCV-IRES-GFP中,获得定向插入重组子pMSCV-TFPI-IRES-GFP,采用酶切图谱分析和测序进行鉴定.用磷酸钙法经293T细胞包装,收集病毒上清,感染EPCs.用荧光显微镜和流式细胞术观察感染后细胞内GFP表达情况.RT-PCR检测EPCs中TFPI mRNA的表达水平,ELISA法检测EPCs细胞培养上清中TFPI蛋白的含量.结果 经限制性内切酶酶切图谱分析证实重组病毒中含有人TFPI的cDNA片段,基因测序结果与Genebank中TFPI cDNA序列相符.荧光显微镜观察及流式细胞仪检测显示,90%以上的感染细胞中存在GFP表达;RT-PCR分析显示,重组病毒感染细胞中TFPI mRNA水平明显增高;ELISA法检测发现,感染重组病毒的EPCs培养上清中有TFPI蛋白表达.结论 本研究成功构建重组pMSCV-TFPI-IRES-GFP真核表达载体,其在EPCs中能够同时表达TFPI和GFP,为TFPI基因结合血管内皮祖细胞进行血管再狭窄防治研究的进一步深入开展奠定了良好实验基础.     

人脐动脉平滑肌细胞培养及转染TFPI基因的实验研究

目的 探讨组织因子途径抑制因子（TFPI）基因对人脐动脉血管平滑肌细胞生长的影响,为TFPI基因用于血管再狭窄的治疗提供理论依据和实验基础.方法 从人脐动脉分离平滑肌细胞,通过免疫组化方法进行细胞鉴定;用不同剂量pIRES-TFPI基因（分别为1,2,3 μg/mL）转染血管平滑肌细胞,采用RT-PCR测定细胞内TFPI表达以优化基因转染条件;通过MTT法测定TFPI基因对人脐动脉血管平滑肌细胞生长的影响.结果 分离得到的血管平滑肌细胞的纯度高于90%;3个剂量的基因转染后,细胞内TFPI基因的表达水平无明显差异.采用2 μg/mL转染剂量时,TFPI基因转染后第5天,脐动脉血管平滑肌的生长受到明显抑制.结论 通过基因转染的方式将TFPI基因导入细胞对人脐动脉平滑肌的增殖具有抑制作用.     

双顺反子表达人组织因子途径抑制因子和绿色荧光蛋白重组病毒的构建及其在内皮祖细胞中表达

目的 构建双顺反子表达人组织因子途径抑制因子（TFPI）与绿色荧光蛋白（GFP）的逆转录病毒表达载体pMSCV-TFPI-IRES-GFP,并观察其在大鼠内皮祖细胞（EPCs）中的表达,为进一步研究TEPI在预防血管再狭窄中的作用奠定基础.方法 将人全长TFPI cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pMSCV-IRES-GFP中,获得定向插入重组子pMSCV-TFPI-IRES-GFP,采用酶切图谱分析和测序进行鉴定.用磷酸钙法经293T细胞包装,收集病毒上清,感染EPCs.用荧光显微镜和流式细胞术观察感染后细胞内GFP表达情况.RT-PCR检测EPCs中TFPI mRNA的表达水平,ELISA法检测EPCs细胞培养上清中TFPI蛋白的含量.结果 经限制性内切酶酶切图谱分析证实重组病毒中含有人TFPI的cDNA片段,基因测序结果与Genebank中TFPI cDNA序列相符.荧光显微镜观察及流式细胞仪检测显示,90%以上的感染细胞中存在GFP表达;RT-PCR分析显示,重组病毒感染细胞中TFPI mRNA水平明显增高;ELISA法检测发现,感染重组病毒的EPCs培养上清中有TFPI蛋白表达.结论 本研究成功构建重组pMSCV-TFPI-IRES-GFP真核表达载体,其在EPCs中能够同时表达TFPI和GFP,为TFPI基因结合血管内皮祖细胞进行血管再狭窄防治研究的进一步深入开展奠定了良好实验基础.     

影响微球药物释放因素的研究

目的 观察影响微球药物释放的因素，为其应用提供理论基础。方法 以可生物降解的聚乳酸—聚乙醇酸共聚物(PLGA)和聚L—乳酸(PLIA)为载体，采用乳化—溶剂挥发法制备含细胞松弛素B(cytoB)微球，以HPLC测定cy-toB含量。结果 制备了不同球径的微球，其球径分别为150nm、500nm、1μm、5μm、10μm和20μm。体外释放实验证明，球径越小，药物释放速度越快；球径相同时，以PLIA为基材的微球比PLGA的释放慢。结论 可通过选择适当的微球大小和基质材料达到所期望的药物释放过程。     

包载治疗基因的聚合物纳米粒子:I.纳米粒子制备及动物模型基因治疗实验研究

以可生物降解材料聚乳酸聚乙醇酸共聚物(Poly-dl-lactic-co-glycolic,PLGA)为原料,采用多相乳化技术制备载VEGF纳米粒子。并对纳米粒子的粒径,VEGF含量,体外释放等进行了测定。VEGF纳米粒子和VEGF裸质粒被注射到兔下肢缺血模型的缺血部位,通过RT-PCR,免疫组化和血管造影等技术来验证基因治疗的效果,评价VEGF纳米粒子作为基因载体在动物模型基因治疗中的效率。制备的VEGF纳米粒子的平均粒径约为300nm,包埋效率在96%以上,纳米粒子中VEGF含量约4%。可在体外维持恒定释放约两周。两周基因注射结果表明VEGF-NP治疗组与裸质粒VEGF治疗组的毛细血管密度明显高于对照组,VEGF纳米粒子组(81.22permm2),对照组(29.54mm2),两者有显著性差异(P<0.05)。RT-PCR结果显示VEGF纳米粒子组表达(31.79au*mm)明显高于VEGF裸质粒组(9.15au*mm)。在动物模型中VEGF纳米粒子是比裸质粒DNA更好的基因载体系统,结果显示了纳米粒子可望在人类基因治疗中得到很好的应用。     

壳聚糖纳米粒子介导TFPI基因转染的实验研究

目的：评价壳聚糖纳米粒子携带组织因子途径抑制因子（tissue factor pathway inhibitor,TFPI）基因转染的效率及其细胞毒性。方法：制备壳聚糖纳米粒子-TFPI基因复合物，检测其粒度。zeta电位。包埋效率。以Lipofectamine2000为对照，观察血管平滑肌细胞系A10对壳聚糖TFPI基因纳米复合物的摄入速度和数量；利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测体外转染效果；应用噻唑蓝（MTT）评价壳聚糖纳米粒子的体外细胞毒性。结果：壳聚糖TFPI基因纳米复合物的平均粒径约为141nm，zeta电位为6．8mV；其DNA包埋效率和DNA含量分别为（98．8±34）％和（38．1±2．3）％。A10细胞的摄入和转染实验显示其效率与商品化的细胞转染试剂Lipofectamine2000相近，但是其毒性远低于Lipofectamine2000。结论：壳聚糖纳米粒子可高效携带TFPI基因转染平滑肌细胞，而且对细胞基本无毒性。     

抗P21蛋白特定位点单克隆抗体的制备及鉴定

用相当于ras p21蛋白质氨基酸序列56～64位的合成肽与血蓝蛋白偶联作为抗原,利用B淋巴细胞杂交瘤技术成功地得到了分泌抗P21蛋白的单克隆抗体杂交瘤系SE_(11)及EB_(2411)。其抗体亚型分别为IgG_3及IgG_(2a)。本文着重研究了EB_(2411)单抗与人肿瘤细胞的反应性。免疫组化技术检测结果表明,EB_(2411)单抗与人肝癌_(7402)、乳腺癌_(MCF)、胃癌_(823)、肺腺癌_(A2)及肺鳞癌_(78)等细胞系均呈阳性反应。肺癌、肝癌及结肠癌亦呈现不同程度的阳性反应,而与结肠息肉及肺癌癌旁的正常肺泡的反应为阴性。用放射免疫沉淀-SDS-PAGE技术检测Ha-ras_(12val)转化的细胞HR-1,证明EB_(2411)单抗与p21蛋白反应。     

功能化多壁碳纳米管对血管内皮细胞毒性的初步研究

目的:由于碳纳米管的广泛应用,其对人类及环境造成的影响日益受到人们的关注.血管是碳纳米管进入人体的首要通道之一,因此探讨功能化与原始状态的多壁碳纳米管对血管内皮细胞的细胞毒性作用具有重要意义.方法:自人脐静脉分离血管内皮细胞,免疫组化进行细胞鉴定.选择0.5～1 μm经羧基修饰的功能化多壁碳纳米管(f-CNTs)与同等长度未经修饰的多壁碳纳米管(p-CNTs)制备颗粒悬液,与血管内皮细胞共育后,利用噻唑蓝实验(MTT比色法)检测细胞活力,透射电镜进行细胞形态学观察;制备碳纳米管透析液,通过MTT实验检测其对细胞的毒性作用.结果:①2种纳米管均对原代脐静脉内皮细胞(HUVEC)产生一定的毒性作用,而且其细胞毒性随剂量递增呈上升趋势.与细胞共育24 h后,p-CNTs的毒性大于f-CNTs;而共育48 h及72 h后,f-CNTs毒性大于p-CNTs.②透射电镜实验表明,f-CNTs共育细胞内空腔明显多于p-CNTs,而空腔内f-CNTs聚集体紧密程度明显小于p-CNTs.③对2种多壁碳纳米管透析后的细胞培养基对细胞活力无明显影响.结论:根据上述结果笔者推测.p-CNTs细胞毒性的主导因素是聚集程度,f-CNTs对细胞毒性的主导因素为表面效应.进入细胞的碳纳米管数目增多,造成细胞损伤或阻断细胞内代谢通路,可能是共育后期f-CNTs细胞毒性大于p-CNTs的原因.     

生物材料诱发血栓形成机制的研究进展

本文对生物材料诱发血栓的机制进行了综述。着重介绍了材料通过影响血管内皮细胞、组织因子、血小板、基质蛋白和细胞因子等几方面进而引发血栓形成的机制，并对将来生物材料血液相容性的研究方法和从分子水平上设计新型生物材料进行了展望。