参附注射液对大鼠肾缺血再灌注损伤作用的影响

为进一步探讨参附注射液抗休克机制，本文观察了参附注射液对鼠肾缺血再灌注模型超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）及组织形态的影响。结果显示，与缺血再灌组相比，参附注射液组肾外髓水肿明显减轻（Ｐ＜０．０１），ＳＯＤ活性明显增高（Ｐ＜０．０１）。提示保护ＳＯＤ活性、降低脂质过氧化反应的作用是参附注射液抗休克的机制之一。     

大鼠肾缺血再灌注后肾小管上皮细胞凋亡的研究

以动脉错钳夹双侧肾蒂45分钟阻断肾动脉供血制备SD大鼠肾缺血模型后，分别于再灌注的0、12、24、48、72小时分批处死动物，进行肾组织光镜检查、DNA提取物凝胶电泳实验和原位细胞凋亡标记（TUNEL）实验。结果表明：1．缺血再灌注后肾组织的病理变化主要表现为皮，髓交界部的肾小管发生细胞调亡，皮质记质部的肾小管病变较轻，肾小球的改变不明显。2．TUNEL实验表明缺血再灌注后12小时时细胞调亡的水平最高（24．45±2．81个／HP），缺血再灌注当时（0小时时）细胞调亡水平（437±0．65个／HP）与正常组织间（3．67±0．72个／HP）无差异。缺血再灌注24、48、72小时时的细胞凋拦水平呈逐渐下降趋势（分别为20．45±1．38个／HP、13．8±1．37个／HP、9．5±0．79个／HP）。3．凝胶电泳实验显示缺血再灌注的肾组织出现典型的180hP及其倍体的DNA条带。4．至缺血再灌注72小时时病变肾小管内仍可见无核物质的调亡小体存在，其最终被再生的肾小管上皮挤入管腔而排出，并非被巨噬细胞吞噬清除。     

人源特异性抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体的制备及鉴定

目的:利用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)调节亚基(R亚基)的二聚体化功能结构域(DDD)的二聚化功能,制备具有中和活性的人源特异性抗狂犬病毒二价抗体?方法:优化合成linker-C-DDD序列,设计引物扩增抗狂犬病毒抗体Fab094的Fd段和轻链可变区序列(Vκ),通过overlap PCR将Fab094的Fd段和linker-C-DDD基因重组为Fd-DDD,将其和Vκ分别克隆到真核表达载体中,共转染293Free style细胞,表达纯化该抗体?应用SDS-PAGE?Western blot?ELISA?免疫共沉淀?亲和力测定及免疫荧光试验检测该抗体的免疫学特性,用荧光抗体病毒中和试验检测其中和活性?结果:成功构建了全人源抗狂犬病毒二价抗体Fab094-DDD的真核表达载体,获得的二价Fab094-DDD抗体与抗原保持着较好的亲和力,能特异性结合狂犬病毒,中和效价为213.2 U/mg?结论:成功制备了抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体,具有较高的中和活性,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础,对于其他疾病双表位人源特异性抗体的制备也具有借鉴作用?     

全人源抗Trop-2 IgG的制备及对卵巢癌细胞生物特性的影响

目的:构建全人源抗人滋养层细胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen 2,Trop-2)抗体 IgG真核表达系统,表达并纯化该抗体,并检测其对卵巢癌细胞生物特性的影响?方法:构建全人源抗Trop-2抗体IgG的重组表达载体;在293FreeStyle(293F)真核表达体系中表达并纯化该抗体?使用SDS-PAGE?ELISA?亲和力测定?免疫荧光等方法鉴定该抗体并分析其免疫学活性;使用cell counting kit-8(CCK-8)法?划痕实验?Transwell实验和细胞凋亡实验分析其对卵巢癌细胞特性的影响?结果:成功制备出全人源抗Trop-2 IgG;经多种方法检测,该抗体能与Trop-2蛋白特异性结合;对表达Trop-2的卵巢癌细胞增殖?侵袭?迁移和凋亡有明显影响?当抗体浓度为400 μg/mL时,卵巢癌细胞HO8910的生存率仅为55.95%(P < 0.01),划痕愈合率仅为24.71%(对照组为70.80%,P < 0.01),侵袭细胞数是对照组的32.11%(P < 0.05),细胞凋亡率是对照组的2倍(P < 0.05)?结论:全人源抗Trop-2 IgG可特异性识别卵巢癌细胞表面的Trop-2 蛋白,对卵巢癌细胞的恶性行为具有明显的抑制作用?因此,全人源抗Trop-2 IgG在卵巢癌的靶向治疗中有潜在应用价值?     

糖尿病大鼠外周神经病变与胰岛素样生长因子-1基因表达异常的关系

目的探讨肝组织胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor-1,IGF-1)基因表达异常及其与糖尿病外周神经病变的关系.方法实验选用清洁级SD雄性大鼠64只.将64只大鼠按初质量匹配随机分成正常对照组16只和糖尿病组48只.用四氧嘧啶诱发糖尿病大鼠模型,并进一步将糖尿病大鼠按血糖水平分成3组(胰岛素治疗1,2,3组),与正常大鼠组进行实验比较.反转录一多聚酶链扩增反应半定量分析坐骨神经IGF-1 mRNA含量;酶联免疫吸附法分析组织IGF-1肽含量;诱发肌电图测定坐骨神经电生理指标;光镜,电镜下观察坐骨神经形态学改变.结果糖尿病2周时,胰岛素治疗2,3组大鼠肝组织IGF-1mRNA含量明显低于正常对照组,且随病程发展进一步下降(P＜0.01).糖尿病3个月时,胰岛素治疗2,3组大鼠肝组织IGF-1mRNA含量与正常对照组比较,差异有非常显著性意义(P＜0.01).肝组织IGF-1肽含量与IGF-1mRNA几呈平行变化趋势.此变化趋势与肝组织IGF-1肽含量变化一致(r=0.99,P＜0.001).糖尿病2周时,糖尿病组与正常对照组间电生理差异无显著无意义(P＞0.05).糖尿病2,3个月时,胰岛素治疗2,3组大鼠电生理指标与正常对照组比较,差异有显著性意义(P＜0.05～0.01).糖尿病2,3个月时,胰岛素治疗3组与胰岛素治疗2组比较,差异有显著性意义(P＜0.01),胰岛素治疗1组与正常对照组比较,差异无显著性意义(P＞0.05).糖尿病3个月时,与正常对照组及胰岛素治疗1组的髓鞘面积、轴突面积、神经纤维密度[(20.98±0.89),(21.28±1.14)μm2;(25.1±2.94),(27.31±3.21)μm2;(12.17±1.2),(2.14±0.9)×103 mm-2]比较,胰岛素治疗2组和胰岛素治疗3组轴突面积[(18.35±1.00),(14.80±0.76)μm2],髓鞘面积[(22.93±3.13),(18.34±0.90)μm2],神经纤维密度[(10.11±0.32),(8.68±0.30)×103 mm-2]均显著减少或下降.血清IGF-1呈一致性下降(r=0.99,P＜0.001).其变化与坐骨神经功能改变(感觉神经r=0.54,P＜0.025,运动神经r=0.49,P＜0.05)、组织形态异常关系密切(神经纤维密度r=0.68,P＜0.025),血糖正常糖尿病组大鼠与正常对照组间上述指标无显著差异性意义(P＞0.05).结论糖尿病早期即出现肝组织IGF-1基因表达下降,程度依糖尿病严重状态而异并随疾病进程加重,血清IGF-1水平相应地出现变化,提示肝组织为血循环IGF-1的主要来源,这种表达异常可能导致外周神经病变发生和发展.     

EBV编码潜伏膜蛋白2A抗原表位的串联表达及其免疫原性分析

目的:制备具有免疫原性的EB病毒潜伏膜蛋白2A (latent membrane protein 2A,LMP2A)的表位串联蛋白并分析其免疫学特性?方法:用DNAstar软件分析LMP2A的抗原表位,将预测的免疫原性较强的两个表位通过基因合成串联在一起,克隆到原核表达载体pET28a中,经大肠杆菌BL21表达并纯化?制备的含LMP2A表位重组蛋白经SDS-PAGE?Western blot鉴定后,免疫小鼠制备多克隆抗体,以ELISA检测抗体的效价,免疫组织化学法检测该抗体对天然LMP2A的特异性?结果:通过原核表达与纯化,获得高纯度的表位融合蛋白,经小鼠免疫并制备效价高且特异性的小鼠抗LMP2A的多克隆抗体,该抗体可用于ELISA和免疫组织化学分析?结论:本研究制备的表位融合蛋白,具有天然抗原的免疫原性,可制备能特异性识别天然LMP2A分子的多克隆抗体,为利用表位融合蛋白筛选全人源基因工程抗体奠定了基础?     

FISH检测hTERC基因在宫颈腺癌中的扩增及意义

目的:探讨人端粒酶RNA(hTERC)基因在宫颈腺癌中的扩增以及在宫颈腺癌诊断和预后评估中的价值。方法:收集南京医科大学附属南京妇幼保健院2006年1月～2009年12月诊断为宫颈腺癌的石蜡标本38例,并随机抽取同时期诊断为宫颈鳞状上皮内瘤变而腺体正常的37例标本作为对照,采用荧光原位杂交(FISH)方法检测hTERC基因在腺癌及对照组宫颈腺体中的扩增。结果:腺癌组hTERC基因扩增阳性率为84.21%(32/38),对照组阳性率为0%(0/37),两组差异有显著统计学意义(P<0.01)。hTERC基因扩增检测的灵敏度为84.21%(32/38),特异度为100%(37/37),阳性预测值为100%(32/32),阴性预测值为86.05%(37/43)。FISH检测结果显示,不同亚型的宫颈腺癌阳性检出率各不相同,高分化和中-低分化的宮颈腺癌hTERC基因扩增程度存在差异(P<0.05)。对照组杂交信号多为2∶2,而腺癌组异常扩增类型有2∶3、2∶4、2∶5、3∶3、4∶4及N∶N。不同hTERC基因扩增程度的腺癌预后结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论:hTERC基因在宫颈腺癌中扩增,病理分化程度不同...     

人源抗EGFR抗体-鱼精蛋白融合蛋白的制备及活性分析

目的:构建人抗EGFR单链抗体(scFv)/鱼精蛋白截短体(truncated protamine,tP)融合蛋白基因,在大肠杆菌中表达并纯化,分析该融合蛋白的生物学活性?方法:设计引物扩增人抗EGFR单链抗体编码序列,将其克隆于原核表达载体pBAD-A;人工合成tP序列,将其克隆于原核表达载体pBAD-AscFv上,构建成scFv/tP融合基因,在大肠杆菌TOP10F′中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用His-trap镍亲和层析柱纯化?ELISA分析scFv/tP融合蛋白抗原亲合活性,凝胶迁移阻滞实验检测scFv/tP融合蛋白与DNA的结合活性?结果:成功构建了人源抗EGFR抗体/tP融合基因,经L-Ara诱导后在大肠杆菌中实现了可溶性表达?表达的scFv/tP融合蛋白保持了与抗原的结合活性,同时具有结合DNA的能力?结论:scFv与tP融合后,同时具有与抗原和DNA结合的活性,该scfv/tP融合蛋白为EGFR表达阳性肿瘤的靶向基因治疗奠定了基础?     

TK1、Ki-67在非小细胞肺癌组织中的表达及预后意义

目的:探讨细胞质胸苷激酶1(thymidine kinase 1,TK1)和Ki-67在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达水平及其对NSCLC患者预后的意义?方法:将202例NSCLC及63例癌旁肺组织标本制作成组织芯片,采用免疫组织化学EnVision法检测TK1和Ki-67的表达,探讨其表达水平与临床病理特征及预后的关系?结果:NSCLC组织中TK1(60.89%)和Ki-67(55.45%)的阳性表达率均显著高于癌旁肺组织(P < 0.01);Spearman等级相关分析显示二者的表达呈正相关(r = 0.518, P < 0.001);NSCLC中,TK1和Ki-67的表达均与肿瘤分化程度和TNM分期显著相关(P < 0.05);Kaplan-Meier生存分析显示随TK1表达的增强和Ki-67指数的增高,NSCLC患者的总体生存期逐渐降低(P < 0.01);Cox 回归分析提示肿瘤TK1表达和TNM分期是影响NSCLC患者预后的独立危险因素(P < 0.05)?结论:TK1在NSCLC的表达与肿瘤的分化?进展有关,TK1表达有助于对患者预后的评价?     

BRCA2在卵巢肿瘤组织中的表达及临床意义

目的:乳腺癌易感基因2(breast cancer suscepbility gene 2,BRCA2)是近几年发现的新的抑癌基因,本研究旨在分析BRCA2在卵巢癌组织中的表达及其临床意义?方法:采用1对引物扩增BRCA2基因第14外显子,应用聚合酶链反应和基因测序技术检测BRCA2基因,并且应用免疫组化和Western blot检测肿瘤组织BRCA2蛋白的表达?结果:卵巢黏液性囊腺瘤和正常组织BRCA2基因未发生突变,浆液性肿瘤和黏液性囊腺癌的BRCA2第14外显子的128位碱基T突变为C?Western blot检测结果显示BRCA2在卵巢囊腺癌上的表达低于正常卵巢组织和卵巢囊腺瘤,免疫组化检测结果发现BRCA2在卵巢黏液性囊腺瘤和黏液性囊腺癌中的阳性率分别为87.50%和53.33%,差异有统计学意义(P < 0.05);而BRCA2在卵巢浆液性囊腺瘤和浆液性囊腺癌中阳性率分别为53.85%和73.17%,差异没有统计学意义(P > 0.05)?BRCA2蛋白在不同年龄?组织学分型?分化程度和临床分期各组间差异均无统计学意义(P > 0.05)?结论:BRCA2在卵巢癌组织中的表达不仅可以用于诊断,也可能为治疗提供一个途径?