EB病毒潜伏膜蛋白LMP2A对人鼻咽癌细胞增殖与迁移特性的影响

目的:制备重组慢病毒载体pLMP2A,并检测其在人鼻咽癌细胞CNE1的表达情况及潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)对人鼻咽癌细胞CNE1增殖?迁移?侵袭的影响?方法:利用DNA重组技术将EB病毒编码的LMP2A基因克隆到慢病毒表达载体plv-GFP中,通过酶切?测序验证,将重组慢病毒载体pLMP2A与包装质粒pdelta-8.91?pVSVG共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-LMP2A,并感染人鼻咽癌细胞CNE1,经单克隆筛选后,用RT-PCR?免疫荧光和Western blot检测LMP2A在人鼻咽癌细胞CNE1的表达,CCK8法检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1增殖的影响,划痕实验?Transwell侵袭实验检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1迁移和侵袭的影响?结果:酶切及测序结果表明,成功制备了重组慢病毒载体pLMP2A;RT-PCR?Western blot?免疫荧光结果显示筛选出的细胞克隆能高表达EBV-LMP2A,CCK8结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1增殖,划痕实验结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1迁移,Transwell侵袭实验结果显示LMP2A能提高人鼻咽癌细胞CNE1侵袭能力?结论:成功制备了慢病毒载体pLMP2A,包装的慢病毒能够成功感染人鼻咽癌细胞系CNE1,使LMP2A基因得以高表达,并发现LMP2A能够促进人鼻咽癌细胞株CNE1增殖?迁移?侵袭,为进一步探讨EB病毒在鼻咽癌中的发病机制及基因治疗奠定了基础?     

人源抗TLR4抗体IgG的制备及其中和特性分析

目的:构建全人源抗人Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)抗体轻?重链表达载体,在293Free style 细胞中表达并纯化,分析该重组全分子抗体的生物学活性?方法:设计引物扩增全人源抗人TLR4抗体可变区编码序列,将其分别克隆到真核表达载体pFUSE-CHIg-hG1和pFUSE-CLIg-hl中,共转染至293Free style 细胞,表达产物用protein A亲和层析柱纯化?应用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)?Western blot?免疫共沉淀?质谱分析及蛋白芯片检测抗体的免疫学特性,并检测该抗体对人单核细胞淋巴瘤THP1细胞肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α表达的影响?结果:成功构建全人源抗人TLR4抗体真核表达载体,获得的全分子抗TLR4抗体保持了与抗原的结合活性,对THP-1细胞TNF-α表达的抑制率可达85.7%?结论:重组全人源抗TLR4 IgG保持了与TLR4的结合特异性,并具有明显的中和作用,对炎症治疗具有潜在的应用价值?     

全人源抗肝癌重组免疫毒素的制备及其对肝癌细胞的杀伤作用

目的:构建及表达全人源抗肝癌MAGE鄄A1单链抗体(A3)与相思子毒素A链(Abrin鄄A)的原核表达载体,并检测其对人BEL7402肝癌细胞系的杀伤作用。方法:应用PCR方法体外扩增A3基因,经测序后重组入原核表达载体pBAD/gⅢ鄄Abrin鄄A相应位点上,将构建正确的pBAD/gⅢ鄄A3/Abrin鄄A表达质粒转化E.coliTOP10,左旋阿拉伯糖诱导表达。表达产物经蛋白纯化及活性鉴定,采用MTT法检测其对BEL7402细胞的体外杀伤作用。结果:构建的重组免疫毒素表达载体pBAD/gⅢ鄄A3/Abrin鄄A,诱导表达产物主要以包涵体形式存在,分子量约60kD;纯化的pBAD/gⅢ鄄A3/Abrin鄄A对BEL7402细胞的最大杀伤率为70.17%,IC50为3.12μg/ml。结论:构建、表达的全人源抗肝癌A3/Abrin鄄A融合免疫毒素对肝癌细胞有较明显的杀伤作用。     

食管癌组织KAI1/CD82的表达与其生物学行为的关系

目的　探讨食管癌组织和正常食管组织中KAI1/CD82 表达的临床意义及其与生物学行为的关系。方法　应用免疫组化SABC法 ,检测 5 2例食管癌及 3 3例食管正常组织中KAI1/CD82 的表达 ,并进行比较分析。结果　食管正常组织、无淋巴结转移食管癌组织和有淋巴结转移食管癌组织KAI1/CD82 的表达率分别为 48 5 % ( 16/3 3 )、 73 7% ( 2 8/3 8)、 2 8 6% ( 4 /14 ) ,食管正常组织、无淋巴结转移食管癌组织、有淋巴结转移食管癌组织KAI1/CD82 的表达有显著差异 (P <0 0 5 )。结论　KAI1/CD82 在食管癌早期高水平表达对肿瘤的恶性进程起抑制作用 ,一旦无法保持KAI1/CD82 的高水平表达则促使肿瘤进入发展期 ,进而发生转移。     

糖尿病大鼠外周神经病变与胰岛素样生长因子-1基因表达异常的关系

目的：探讨肝组织胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor-1，IGF-1)基因表达异常及其与糖尿病外周神经病变的关系。方法：实验选用清洁级SD雄性大鼠64只。将64只大鼠按初质量匹配随机分成：正常对照组16只和糖尿病组48只。用四氧嘧啶诱发糖尿病大鼠模型，并进一步将糖尿病大鼠按血糖水平分成3组(胰岛素治疗1，2，3组)，与正常大鼠组进行实验比较。反转录一多聚酶链扩增反应半定量分析坐骨神经IGF-1 mRNA含量；酶联免疫吸附法分析组织IGF-1肽含量；诱发肌电图测定坐骨神经电生理指标；光镜，电镜下观察坐骨神经形态学改变。结果：糖尿病2周时，胰岛素治疗2，3组大鼠肝组织IGF-1mRNA含量明显低于正常对照组，且随病程发展进一步下降(P&;lt;0．01)。糖尿病3个月时，胰岛素治疗2，3组大鼠肝组织IGF-1mRNA含量与正常对照组比较，差异有非常显著性意义(P&;lt;0．01)。肝组织IGF-1肽含量与IGF-1mRNA几呈平行变化趋势。此变化趋势与肝组织IGF-1肽含量变化一致(r=0．99，P&;lt;0．001)。糖尿病2周时，糖尿病组与正常对照组间电生理差异无显著无意义(P&;gt;0．05)。糖尿病2，3个月时，胰岛素治疗2，3组大鼠电生理指标与正常对照组比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．05～0．01)。糖尿病2，3个月时，胰岛素治疗3组与胰岛素治疗2组比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．01)，胰岛素治疗1组与正常对照组比较，差异无显著性意义(P&;gt;0．05)。糖尿病3个月时，与正常对照组及胰岛素治疗1组的髓鞘面积、轴突面积、神经纤维密度[(20．98&;#177;0．89)，(21．28&;#177;1．14)μm^2；(25．1&;#177;2．94)，(27．31&;#177;3．21)μm^2；(12．17&;#177;1．2)，(2．14&;#177;0．9)&;#215;10^3mm^-2]比较，胰岛素治疗2组和胰岛素治疗3组轴突面积[(18．35&;#177;1．00)，(14．80&;#177;0．76)μm^2]，髓鞘面积[(22．93&;#177;3．13)，(18．34&;#177;0．90)μm^2]，神经纤维密度[(10．11&;#177;0．32)，(8．68&;#177;0．30)&;#215;10^3mm^-2]均显著减少或下降。血清IGF-1呈一致性下降(r=0．99，P&;lt;0．001)。其变化与坐骨神经功能改变(感觉神经：r=0．54，P&;lt;0．025，运动神经：r=0．49，P&;lt;0．05)、组织形态异常关系密切(神经纤维密度r=0．68，P&;lt;0．025)，血糖正常糖尿病组大鼠与正常对照组间上述指标无显著差异性意义(P&;gt;0．05)。结论：糖尿病早期即出现肝组织IGF-1基因表达下降，程度依糖尿病严重状态而异并随疾病进程加重，血清IGF-1水平相应地出现变化，提示肝组织为血循环IGF-1的主要来源，这种表达异常可能导致外周神经病变发生和发展。     

甲钴胺预防糖尿病大鼠外周神经结构异常的效果

目的：探讨甲钴胺预防不同病程糖尿病外周神经病变的有效性。方法：80只SD大鼠随机选取16只作为正常对照组（NC组）;64只四氧嘧啶诱导糖尿病模型,模型成功后根据外源胰岛素控制血糖水平,将血糖控制较好的大鼠分为ID-1组和M-ID-1组各16只;血糖控制较差的分为ID-2组和M-ID-2组各16只,M-ID-1和M-ID-2组均每日肌注甲钴胺500μg/kg。12周后各组大鼠麻醉下切除坐骨神经,在光镜和电镜下检测坐骨神经纤维结构,并监测果糖胺等糖代谢情况。结果：与NC组比较,其它各组均出现神经结构异常。与其它模型组比较,M-ID-1组（果糖胺1.0 mmol/L）坐骨神经纤维结构异常明显减少（P〈0.05）;M-ID-2组（果糖胺1.2 mmol/L）与ID-2组比较,纤维结构改变无差别。结论：甲钴胺对外周神经病变的延缓效应在一定病程内受血糖的影响,血糖控制较好则效果较好。     

全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定

目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性?方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库?以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性?结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0 × 107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv?经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体?经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg?结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础?     

食管癌和癌旁组织中诱导型一氧化氮合酶的表达及临床意义

目的：通过对食管癌及癌旁组织中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的定位，半定量研究，探讨一氧化氮（NO）在癌组织中的生成情况及意义。方法：用免疫组化的方法对iNOS进行定位和半定量,工且用秩和检验和SAS软件进行统计学分析，结果：iNOS位于细胞质／细胞膜，正常食管粘膜组织表达为阴性，癌旁组织呈弱表达，食癌组织中呈阳性表达，高分化食管癌呈强阳性表达。正常粘膜组织、癌旁组织与食管癌组织之间iNOS的表达差异有显著性（P＜0．01），食管癌组织中高分化，中分化，低分化之间iNOS的表达差异也有显著性（P＜0．05），而且随分化程度降低，iNOS表达也降低，结论：iNOS蛋白在食管癌组织中呈大量表达，iNOS的表达与食管癌的分化程度有关。     

表皮葡萄球菌污染对质粒转化和抽提影响的实验研究

目的：探讨导致部分质粒转化和抽提失败的原因，方法：使用同一批DH5－α细菌制备感受态，转化、碱裂解法抽提和鉴定两种质粒，经抗性LB琼脂平板筛选和菌落分析，对照成功抽提和鉴定的质粒，分析部分质粒反复转化和抽提失败的原因，结果：发现在该抽提失败的质粒所转化的抗性LB琼脂平板上存在两种菌落，大量白色菌落为表皮葡萄球菌，其过夜振摇产物经碱裂解法抽提质粒失败，极少数淡黄色菌落为大肠杆菌，经鉴定，质粒抽提成功，结论：隐蔽的表皮葡萄球菌污染可能是导致部分质粒反复抽提失败的重要原因。     

PTTG基因在人乳腺癌中的原位表达及其意义

目的　研究PTTG基因在乳腺癌表达的临床病理意义。方法　应用原位杂交 (DNA RNA)技术检测 66例人乳腺癌、2 7例乳腺小叶增生及 5 4乳腺正常组织中PTTGmRNA。结果　PTTGmRNA在乳腺癌、乳腺小叶增生和乳腺正常组织阳性率分别为 71 2 % (4 7/66)、5 1 9% (14 /2 7)和 11 1% (6/5 4) ,乳腺癌和乳腺正常组织之间有显著差异 (P <0 0 5 ) ,乳腺小叶增生和乳腺正常组织之间也有显著差异 (P <0 0 5 ) ;PTTGmRNA的表达与淋巴结转移无统计学意义 (P >0 0 5 )。结论　PTTG基因的过度表达可能参与了人乳腺癌的发生发展过程