人源Fab抗体库的构建和抗HBsAg抗体的筛选和鉴定

目的 构建人源Fab抗体文库,筛选抗HBsAg 抗体片段并进行初步鉴定.方法 收集20份临床检验废弃的成人乙肝感染者淋巴细胞,抽提总RNA ,逆转录成cDNA,构建抗乙肝病毒人源免疫型Fab抗体文库.以HBsAg包板进行4轮循环的吸附-洗脱-扩增,挑单克隆用Phage-ELISA、DNA测序筛选阳性克隆,对阳性克隆进行可溶性表达,并用ELISA对其特异性进行鉴定.结果 构建的人源Fab型抗体文库的库容为2.0×108,并具有良好的多样性.经过4轮筛选,成功获得4株能与HBsAg结合的人源抗体克隆,分别命名为hFabHB1、hFabHB2、hFabHB3 和hFabHB4.对其中的hFabHB1进行可溶性表达,ELISA鉴定阳性.结论 成功构建了抗乙肝病毒人源免疫型Fa b抗体文库,从中筛选获得的4株人源Fab抗体片段有望在乙型肝炎的预防和治疗上发挥作用 .     

血管内放射抑制猪髂动脉球囊损伤后狭窄形成的动态观察及机制探讨

目的：评价血管内放射抑制猪髂动脉球囊损伤后狭窄形成的可行性、有效性及其作用机制。方法：小型家猪１３头,分为对照组7头及实验组6头 。对照组左侧髂动脉先行造影及血管内超声检查,随后行球囊扩张成形术,最后置入置源管。实验组在上述处理基础上,通过置源管送入^192Ir高剂量后装源取20Gy对受损髂动脉行放射治疗。术后第3天、第10天及第28天各处死2头,取损伤的髂动脉分别行苏木精－伊红及Masson染色,计算机图像分析系统分析形态学及组织学变化。结果：对经球囊损伤后的猪髂动脉进行血管内放射在技术上是可行的,未见并发症发生。实验组在不同时间点与对照组相比较均可见新生内膜面积及厚度减少、血管腔面积及外弹力膜包绕面积增加现象;新生内膜中胶原含量有增生受抑现象。结论：在球囊扩张成形术后即刻应用血管内^192Ir 20Gy放射治疗,第３天起明显抑制新生内膜形成,第10天时新生内膜抑制达到高峰,血管发生有意义的正性重塑,到28天时血管正性重塑更加明显,从而达到有效抑制动脉损伤后狭窄形成的效果。     

融合蛋白诱导机体免疫的现状与思考

融合蛋白是利用基因工程技术构建的人工蛋白,可以优化蛋白性能,甚至产生新功能。在抗肿瘤和抗寄生虫病免疫等方面具有巨大的应用前景。面对众多研究策略,本文试图从如何有效激发机体免疫,尤其是从细胞免疫角度,探讨融合蛋白的研究现状、作用机制、存在问题和可能的发展方向。     

日本血吸虫单克隆独特型抗体的筛选及初步鉴定

目的 从本实验室已建立的IgG类抗日本血吸虫抗原不同表位的单抗中筛选抗独特型抗体NP30的独特型抗体（id,Ab1)。方法 应用间接DLISA经典法,NP30作为抗原包板。加IgG各亚类杂交瘤细胞培养上清孵育,用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗鼠IgG捕捉。结果 单抗NP56与NP30呈阳性反应,NP56的Ig同型为IgG2b。免疫组织化学显示NP56与虫卵内毛蚴头腺及毛蚴膜呈阳性反应。结论 NP56是NP30的特异性id,可用于NP30模拟抗原的鉴定。     

人源抗EB病毒潜伏膜蛋白1抗体Fab联合丝裂霉素C对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的:观察联合应用人源抗EB病毒鼻咽癌潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)抗体Fab片段与丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)对LMP1阳性鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法:建立LMP1阳性鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,20只成瘤裸鼠随机分成4组,即Fab组、MMC组、Fab+MMC组和对照组。腹腔注射药物,每3天1次,共5次。观察肿瘤生长、测量肿瘤体积,计算抑瘤率。免疫组化法检测肿瘤组织血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达、流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况。结果:Fab组、MMC组和Fab+MMC组抑瘤率分别为18.90%、28.95%、49.12%。Fab组、Fab+MMC组VEGF表达量明显低于对照组(P<0.05)。MMC组VEGF表达量和对照组相比,无统计学意义(P>0.05)。MMC组、Fab+MMC组肿瘤细胞凋亡率分别为(11.84±1.50)%、(17.55±3.21)%,与对照组凋亡率(3.90±0.55)%相比,有显著差异(P<0.01);Fab组凋亡率为(7.34±2.68)%,与...     

非小细胞肺癌VEGFR-2的表达及临床意义

目的:探讨血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2)在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)中的表达及其与临床病理特征?预后的关系?方法:采用组织芯片技术和免疫组织化学方法检测VEGFR-2在217例非小细胞肺癌中的表达情况,并结合临床病理资料进行单因素生存分析?结果:VEGFR-2在NSCLC中高表达,阳性率为63.1%,且该基因的表达与肿瘤分化程度?TNM分期?淋巴结转移?神经侵袭有显著相关性(P < 0.05)?VEGFR-2的表达与NSCLC的预后相关,阳性表达该基因的患者的平均中位生存期比阴性表达的患者长12个月(P=0.049)?结论:VEGFR-2基因在非小细胞肺癌的发生?发展过程及预后具有重要作用?     

SPP-1、GDF-15和CXCL-1在人小肝癌中表达的初步研究

目的:针对前期应用基因芯片(Affymetrix Rat Genome 230.2.0)筛选出的大鼠早期肝癌中高表达的人同源分泌蛋白基因SPP-1、GDF-15和CXCL-1,定量验证其在人小肝癌中mRNA和血清蛋白的表达水平,并探讨其临床应用价值。方法:应用实时定量PCR和双抗体夹心法ELISA,检测15例小肝癌及正常肝脏组织(癌旁正常肝脏组织)的mRNA水平及对应小肝癌血清和正常人血清中的蛋白表达水平。结果:①SPP-1、GDF-15和CXCL-1基因在小肝癌组织中较对照组表达显著上调,其差异有统计学意义(P<0.05);②SPP-1血清蛋白检测值与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);GDF-15血清蛋白含量在小肝癌组中表达水平明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05);小肝癌组中CXCL-1血清蛋白含量较正常对照组表达下调,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:①NF-κB信号通路基因(CXCL-1)、P53信号通路基因(GDF-15)和SPP-1基因在人小肝癌组织中高表达,可能与肝癌发生的早期过程相关;②分泌性蛋白GDF-15和CXCL-1显示出小肝癌筛选诊断的潜在价值。     

肿瘤相关抗原Trop-2胞外区片段蛋白的表达及其特性分析

目的:从临床乳腺癌组织中扩增肿瘤相关抗原Trop-2胞外肽段基因,在大肠杆菌中表达重组蛋白,并对该蛋白的生物学特性进行鉴定。方法:RT-PCR扩增Trop-2胞外肽段基因并克隆于pMD18-T载体中进行测序分析,用NcoⅠ和EcoRⅠ将含Trop-2胞外区重组基因的质粒双酶切后,克隆到pBAD-gⅢ中。重组质粒经酶切鉴定、核酸序列分析后转化大肠杆菌TOP10,以L-阿拉伯糖诱导表达融合蛋白,表达的蛋白经后His柱亲和层析纯化后,用Western blot、ELISA检测鉴定。结果:重组表达质粒经酶切鉴定为阳性,核酸序列分析正确。SDS-PAGE和Western blot显示,表达的重组蛋白分子质量约为38ku,此抗原能够与商业化抗体特异性结合。结论:成功制备Trop-2胞外区重组基因表达的蛋白,并证明原核表达的Trop-2胞外肽段保持了原有的抗原性。     

CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体并观察其介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对人肝癌细胞CTGF(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响?方法:针对已经筛选确定的人CTGF基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Plk0.1-GFP-SP6载体连接产生shRNA 慢病毒载体,经PCR筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定?用脂质体转染法将质粒共转染293T 细胞,将包装产生的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,Real-time PCR?Western-blot检测CTGF mRNA和蛋白的表达?结果:PCR与DNA测序证实合成的含CTGF shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确?经RNA干扰后的靶细胞CTGF mRNA以及蛋白表达水平明显降低?结论:成功构建人CTGF基因RNA干扰慢病毒载体,体外感染HepG2细胞可有效降低CTGF mRNA和蛋白的表达,为以CTGF基因为靶点的肝癌基因治疗研究奠定了基础?     

食管癌术前辅助化疗诱导癌细胞凋亡和相关基因表达的临床研究

目的研究食管癌术前辅助化疗中癌细胞凋亡和相关基因p21、p53、Bcl-2表达的关系。方法50例术前采用顺铂和氟尿嘧啶小剂量联合化疗的食管癌手术切除标本(术前化疗组)与50例食管癌手术切除标本(单纯手术组)经免疫组化方法检测p21、p53、Bcl-2的表达水平及细胞凋亡的情况。结果单纯手术组中p21、p53和Bcl-2的阳性表达率分别为54%(27/50)、68%(34/50)和56%(28/50),癌细胞凋亡指数(AI)为(1.992±1238)%;术前化疗组中p21、p53及Bcl-2的阳性表达率分别为52%(26/50)、50%(25/50)和52%(26/50),AI为(3112±1551)%。p21阳性表达时凋亡指数高于其阴性表达,p53阳性表达时凋亡指数低于其阴性表达。结论术前化疗能明显诱导食管癌细胞凋亡,p21和p53的阳性表达与癌细胞凋亡有密切关系,检测p21和p53的表达水平可以协助判断食管癌的分化程度及预后。化疗后Bcl-2随着病理分级的上升,阳性表达率明显提高,提示低分化肿瘤可能对化疗药物有耐受的倾向。