C57小鼠肝、肾、脾、胸腺组织时钟基因的表达特点

目的探测不同脏器组织中时钟基因的表达水平及其波动性。方法用实时荧光定量PCR方法检测C57小鼠肝、肾、脾和胸腺中4种重要时钟基因mBMAL1、mPER1、mCRY1和mCRY2的表达。结果肝和肾中4种时钟基因的表达水平均有显著波动(P<0.01);而脾中仅mBMAL1、mPER1、mCRY1的节律性表达明显(P<0.01,P<0.001,P<0.05),并且波动振幅较为平和;胸腺中4种时钟基因的表达均不具备昼夜波动的特征,同时表达水平也与其他3种组织存在显著差异(P<0.01)。时钟基因所构成的环路在不同组织中也不尽相同,mPER1的负反馈效应在肝中较为主要,mCRY1和mCRY2的负反馈效应在肾和脾中较为主要。结论不同周围组织的分子时钟存在着显著的差异,其相关正负反馈元件和环路有待进一步研究阐明。     

人重组NT-3基因体外转染胚胎干细胞及其表达

目的 探讨神经营养素-3(NT-3)基因体外转染小鼠胚胎干细胞(ES)的可能性及其表达情况.方法 用脂质体介导的方法,将重组真核表达载体PCDNA-3.1(+).NT-3瞬时转染ES.用细胞免疫组化及RT-PCR检测转染细胞NT-3蛋白及mRNA表达.ELISA检测细胞分泌上清液中NT-3蛋白表达.结果 细胞免疫组化结果显示,转染NT-3基因的ES细胞胞浆呈红色染色;RT-PCR得到200 bp的基因片段;ELISA检测细胞分泌上清液中NT-3蛋白表达呈阳性,与对照组有显著差别(P＜0.05).结论 重组真核表达载体PCDNA-3.1(+).NT-3可成功转染ES,获得稳定表达NT-3的ES细胞株.     

帕金森病MPTP食蟹猴模型嗅球细胞凋亡

目的 建立1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶（MPTP）帕金森病（PD）模型,探讨模型组嗅球细胞凋亡和胶质细胞增生情况。方法 3只成年健康食蟹猴,静脉注射MPTP建立PD模型,另3只静脉注射生理盐水作为对照。取出嗅球,免疫组织化学染色检测Caspase-3、Bcl-2、离子钙接头蛋白分子1（Iba-1）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在食蟹猴嗅球中的表达情况,采用Image J v1.8.0软件分析模型组和对照组之间的差异。 结果 MPTP损伤后,与对照组相比,模型组嗅球突触小球层Caspase-3阳性细胞数明显增加,而Bcl-2表达减少;与对照组相比,模型组嗅球突触小球层和外网状层的GFAP和Iba-1阳性细胞数增加。 结论 MPTP可诱导食蟹猴嗅球突触小球层细胞凋亡,并伴有星形胶质细胞增生和小胶质细胞激活,这可能与帕金森病的功能障碍有关。     

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶对食蟹猴嗅球多巴胺能神经元的影响

目的 建立食蟹猴1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)帕金森病系统性模型,探讨嗅球中多巴胺（DA）及多巴胺/cAMP调节磷蛋白（DARPP32）的表达情况。
方法 3只成年健康食蟹猴,静脉注射MPTP,建立帕金森病系统性模型,取出嗅球,切片,免疫组织化学染色DA和DARPP32,摄片并观察DA和DARPP32在食蟹猴嗅球中的分布及表达情况,采用Image Pro-Plus软件,半定量分析模型组和正常组之间DA和DARPP32的表达差异。 结果 食蟹猴嗅球中DA和DARPP32神经元集中分布于突触小球层,DA神经纤维分布于突触小球层,而DARPP32神经纤维分布于嗅球各层,以突触小球层（GL）和外网状层（EPL）最为密集。MPTP损伤后,与正常对照组比较,DA和DARPP32神经元及神经纤维均减少,以DA神经元及神经纤维减少明显。 结论 食蟹猴嗅球中DA神经元和神经纤维分布于突触小球层。食蟹猴MPTP帕金森病系统性模型的嗅球DA能神经元和纤维明显减少,可能与帕金森病嗅觉障碍有关。     

人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养**

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清 DMEM 培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数10%胎牛血清的 DMEM/F12培养液进行诱导分化。结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物 nestin。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6.0%-7.0%;BrdU 掺入实验显示细胞增殖率为37.9%。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型β微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

瞄准疾病的利器——英美科学家因基因靶向技术获2007年诺贝尔生理学或医学奖

瑞典卡罗林斯卡医学院2007年10月8日宣布,将2007年诺贝尔生理学或医学奖授予美国人马里奥.卡佩基、奥利弗.史密斯和英国人马丁.埃文斯,以表彰他们在改造活体内特定基因的基因靶向技术等方面做出的奠基性贡献。本文从3位获奖科学家的简介、主要贡献和基因靶向技术的意义等方面进行综述。     

全骨髓培养法扩增小鼠内皮祖细胞

背景：对于小型实验动物,通过分离骨髓单个核细胞进行内皮祖细胞培养、扩增的方法较为繁琐。 目的：探讨采用全骨髓培养方式扩增小型动物内皮祖细胞的可行性。 方法：采用全骨髓培养分离C57BL/6小鼠内皮祖细胞,培养第7天行DiL-acLDL和FITC-UEA-1双荧光染色检测,并利用流式细胞仪检测其CD34、FLK-1表达情况。同时检测其体外血管生成能力,黏附、增殖和迁移能力。设立骨髓单个核细胞培养法为对照。 结果与结论：全骨髓培养至第2天便可见早期内皮祖细胞集落形成,第7天时可见大量短梭状内皮祖细胞,其具有吞噬DiL-acLDL及结合FITC-UEA-1的能力,内皮祖细胞在基质胶上同样能够形成血管样结构,培养至第2周晚期内皮祖细胞集落出现,迅速生长形成典型的铺路石样,并能够在体外传代培养,细胞数量、细胞表面CD34、FLK-1表达、体外黏附、增殖和迁移能力及晚期集落出现时间与对照组差异无显著性意义(P > 0.05)。说明采用全骨髓培养的方式能够实现小型动物内皮祖细胞的筛选扩增,且操作简便。     

胰酶和Ⅳ型胶原酶在人胚胎干细胞传代中的作用特点

目的对比人胚胎干细胞(hESC)培养过程中不同的酶消化细胞的特点,探讨适合hESC长期体外培养的消化传代方法。方法将正常生长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)滋养层上的hESC分别用0.05%胰酶-EDTA和Ⅳ型胶原酶消化,重新接种,了解两种酶消化后的细胞存活率、克隆形成数量、细胞产量、冻存-复苏后细胞的存活率以及长期传代后细胞核型情况。结果用0.05%胰酶-EDTA消化传代后形成的克隆大小均一,每代第3d可获得碱性磷酸酶(AP)阳性克隆数(21.2±3.5)个/10倍视野,每次传代时hES细胞产量可达(4.56±1.29)×105/cm2,传代时细胞存活率高达95.60%,经冻存-复苏后也有81.20%细胞存活率。用Ⅳ型胶原酶消化组每代仅可获得低浓度胰酶消化组AP阳性克隆数的一半,克隆大小不均,细胞产量也比低浓度胰酶消化组少,传代时细胞存活率和复苏后细胞存活率和低浓度胰酶组相似。分别用两种酶处理传代十余代,核型均无异常。结论两种酶消化均适用于hESC培养,二者作用特点不完全相同,分别适用于不同的实验需要。     

利用巢式聚合酶链反应检测单个胚胎小体细胞中时钟基因的表达

目的建立一组灵敏的检测时钟基因(c lock gene)的巢式聚合酶链反应(nested PCR)方法,并检测小鼠胚胎小体(EB)来源的单细胞中重要时钟基因的表达情况。方法培养小鼠胚胎干细胞(mESC),体外诱导分化为EB,提取总RNA并进行反转录,用BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因特异引物进行巢式聚合酶链反应,电泳检测扩增产物,从而建立相应的巢式PCR反应体系。利用膜片钳获取胚胎小体来源的单个细胞,通过巢式PCR反应检测相应时钟基因的表达情况。结果确定了BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因的扩增参数。证明在此条件下无非特异扩增,并且能够检测到至少两个拷贝的目的分子。利用此检测体系发现,部分胚胎小体细胞中BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2时钟基因环路不完整。结论巢式PCR方法能够灵敏地、而且特异地从单细胞中检测出一组时钟基因的表达,时钟基因的转录在胚胎小体细胞中并不一致,即时钟基因的环路不完整。时钟基因可能在细胞分化过程中发挥着某种作用。     

小鼠胚胎干细胞的体外培养及诱导分化成酪氨酸羟化酶阳性神经元

探索小鼠胚胎干细胞 (ES)在体外培养及向酪氨酸羟化酶阳性神经元诱导分化的可能性。将小鼠胚胎干细胞在含有白血病抑制因子 (LIF)的ES培养基中扩增 ,并通过以下几个步骤 :胚胎体的形成、巢蛋白 (Nestin)阳性细胞的筛选、Nestin阳性细胞的体外扩增及撤除碱性成纤维细胞生长因子等后观察向酪氨酸羟化酶阳性神经元的分化。结果表明小鼠胚胎干细胞在含有LIF的特定培养基中能够稳定传代并保持不分化状态 ,经过无血清培养基的筛选和培养 ,在SonicHedgehog(SHH)及成纤维细胞生长因子 (fibroblastgrowthfactor 8,FGF8)等细胞因子的作用下能定向分化成酪氨酸羟化酶阳性神经元。这种方法有望为帕金森病等神经变性病的细胞移植治疗提供充足的细胞来源。