胚胎干细胞"五步法"体外诱导成为神经细胞的实验观察

目的采用"五步法"将鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)诱导成为神经元和胶质细胞.方法首先将ES细胞接种到铺有明胶的培养瓶里,在无滋养层细胞的情况下生长3 d,然后将细胞悬浮培养4 d成为胚胎体(,胚胎体经过无血清培养基培养6 d,富集nestin阳性细胞,在有丝分裂原bFGF作用下扩增6 d,最后经过烟酰胺诱导分化6 d,共计经过5个步骤.结果诱导出多量表达Tuj-1的不成熟神经元(约占分化后细胞数量的80%～90%)和表达神经胶质纤维酸性蛋白的星形胶质细胞(5%～10%),还有少量表达微管相关蛋白Ⅱ的成熟神经元(5%～10%).结论"五步法"诱导使胚胎干细胞在分化过程中处于不同的阶段,最终诱导出大量不成熟的神经元,少量星型胶质细胞和成熟神经元.为利用不同成熟度的分化细胞移植治疗神经系统疾病提供了充足的细胞来源.     

小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元

目的探讨小鼠胚胎干细胞在体外培养向GABA能神经元定向诱导分化的可能性。方法将小鼠胚胎干细胞以"无血清"方法培养,用DMEM/F12、N2、B27及NT4作为诱导分化剂定向诱导分化,分化好的细胞利用免疫荧光技术、流式细胞技术和RT-PCR鉴定。结果在胚胎干细胞诱导分化成神经元后期,免疫荧光显示有GABA能神经元存在;RT-PCR结果证实有GABA能神经元正确分化的重要调控基因Viaat、Gad1和Gad2基因表达;流式细胞仪计数结果显示GABA阳性细胞约占总细胞数的(11.49±6.86)%。结论小鼠胚胎干细胞经体外培养可以定向诱导分化成GABA能神经元,可作为神经移植的新来源。     

干细胞脑内移植有效标记研究：绿色荧光蛋白质粒标记的应用价值

观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)质粒转化小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)的效果，以及将转化的胚胎干细胞移植入正常大鼠纹状体后，GFP质粒作为细胞存活情况示踪剂的效果。方法：首先利用感受态大肠杆菌提取大量高纯度GFP质粒DNA，然后将GFP质粒与脂质体孵育形成的转化复合物和小鼠胚胎干细胞共同孵育，使GFP质粒转入胚胎干细胞；筛选表达GFP的胚胎干细胞。将筛选后表达GFP的ESC移植入活体大鼠纹状体内，移植21d后，观察表达绿色荧光蛋白的移植细胞的存活情况。结果：GFP质粒转化以后的ES细胞团和单细胞都表达亮绿色的GFP，细胞打散计数证实大约60％的细胞携带GFP，移植21d后，大鼠脑内可见大量表达GFP的移植细胞。结论：脂质体可以将GFP质粒转入鼠的胚胎干细胞，携带有GFP的ES移植后21d，GFP可以作为示踪剂观察移植细胞的存活状况。脂质体辅助的GFP质粒转化胚胎干细胞是移植示踪的较好方法。     

子宫肌瘤与雌激素受体α基因多态性关系的临床研究

目的研究在中国汉族人群中,子宫肌瘤的发生与雌激素受体α（ERα）基因多态性之间的关系。方法采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）来扩增ERα基因序列,用限制性内切酶对193名健康女性和92名子宫肌瘤患者的ERα基因扩增产物进行酶切,测定其基因多态性。结果 ER基因XbaI基因型及PvuⅡ基因型在子宫肌瘤组与对照组之间的分布无显著性差异（P=0.862及0.918）,XbaI基因型等位基因（x、X）及PvuⅡ基因型等位基因（p、P）的分布两组比较均无显著性差异（P=0.893及0.781）。结论在中国汉族人群中,ERα基因多态性与子宫肌瘤的发生并无相关性。     

全骨髓培养法扩增小鼠内皮祖细胞

背景：对于小型实验动物,通过分离骨髓单个核细胞进行内皮祖细胞培养、扩增的方法较为繁琐。目的：探讨采用全骨髓培养方式扩增小型动物内皮祖细胞的可行性。方法：采用全骨髓培养分离C57BL/6小鼠内皮祖细胞,培养第7天行DiL-acLDL和FITC-UEA-1双荧光染色检测,并利用流式细胞仪检测其CD34、FLK-1表达情况。同时检测其体外血管生成能力,黏附、增殖和迁移能力。设立骨髓单个核细胞培养法为对照。结果与结论：全骨髓培养至第2天便可见早期内皮祖细胞集落形成,第7天时可见大量短梭状内皮祖细胞,其具有吞噬DiL-acLDL及结合FITC-UEA-1的能力,内皮祖细胞在基质胶上同样能够形成血管样结构,培养至第2周晚期内皮祖细胞集落出现,迅速生长形成典型的铺路石样,并能够在体外传代培养,细胞数量、细胞表面CD34、FLK-1表达、体外黏附、增殖和迁移能力及晚期集落出现时间与对照组差异无显著性意义（P〉0.05）。说明采用全骨髓培养的方式能够实现小型动物内皮祖细胞的筛选扩增,且操作简便。     

人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清DMEM培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数1O％胎牛血清的DMEM,F12培养液进行诱导分化。结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物nestir。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6．0％-7．0％;BrdU掺入实验显示细胞增殖率为37．9％。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型B微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

全骨髓培养法扩增小鼠内皮祖细胞☆

背景:对于小型实验动物,通过分离骨髓单个核细胞进行内皮祖细胞培养、扩增的方法较为繁琐.目的:探讨采用全骨髓培养方式扩增小型动物内皮祖细胞的可行性. 方法:采用全骨髓培养分离C57BL/6小鼠内皮祖细胞,培养第7天行DiL-acLDL和FITC-UEA-1双荧光染色检测,并利用流式细胞仪检测其CD34、FLK-1表达情况.同时检测其体外血管生成能力,黏附、增殖和迁移能力.设立骨髓单个核细胞培养法为对照. 结果与结论:全骨髓培养至第2天便可见早期内皮祖细胞集落形成,第7天时可见大量短梭状内皮祖细胞,其具有吞噬DiL-acLDL及结合FITC-UEA-1的能力,内皮祖细胞在基质胶上同样能够形成血管样结构,培养至第2周晚期内皮祖细胞集落出现,迅速生长形成典型的铺路石样,并能够在体外传代培养,细胞数量、细胞表面CD34、FLK-1表达、体外黏附、增殖和迁移能力及晚期集落出现时间与对照组差异无显著性意义(P>0.05).说明采用全骨髓培养的方式能够实现小型动物内皮祖细胞的筛选扩增,且操作简便.     

Bmi-1基因对人类胚胎纹状体来源神经干细胞凋亡的影响

目的探讨Bmi-1基因对人类胚胎纹状体来源神经干细胞(neural stem cell,NSC)凋亡的影响。方法提取16~18周自然流产胚胎脑组织纹状体的NSC,体外培养至3~5代,用慢病毒载体对其进行Bmi-1基因的RNA干扰和过表达回复。观察Bmi-1基因对体外NSC凋亡的影响。结果在感染后2 h和3 d两个时间点,Bmi-1基因的RNA干扰显著增加了体外培养的NSC的凋亡率。结论 Bmi-1基因对于体外培养的NSC具有抑制其凋亡的作用,在分析该基因对NSC增生、自我更新等生物学属性的影响时,应当将Bmi-1基因的抗凋亡作用考虑在内。