人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。 目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。 方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清DMEM培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/ F12培养液进行诱导分化。 结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物nestin。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6.0%-7.0%;BrdU掺入实验显示细胞增殖率为37.9%。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型β微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

食蟹猴脑室下区成体神经前体细胞培养及鉴定

目的分离、培养成年食蟹猴脑室下区神经前体细胞并研究其生物学特性。方法取成年食蟹猴脑室下区组织,经木瓜蛋白酶和脱氧核糖核酸酶消化后,接种于DMEM-F12无血清培养基中。结果神经前体细胞可以增殖形成神经球,经免疫细胞化学方法检验这些细胞呈现巢蛋白nestin阳性,神经球分化后的细胞表达胶质细胞的标记物及神经元的标记物。脑室下区来源的神经球进行自主分化时可分化成神经元和胶质细胞,但分化成神经元的比例都很少。结论从食蟹猴脑室下区分离培养的细胞可以在体外增殖形成神经球,并可分化为神经元和胶质细胞,符合神经前体细胞的生物学性状。     

Oct-4在胚胎来源神经前体细胞向神经元分化中的作用

目的应用RNA干扰方法抑制胚胎来源神经前体细胞Oct-4基因表达,以观察Oct-4基因在胚胎来源神经前体细胞向神经元分化中的作用。方法采用“五步法”诱导小鼠胚胎干细胞向神经元分化,进入扩增期后给予Oct-4干扰RNA,采用Real-timePCR方法检测干扰后细胞Oct-4表达情况,进行分化计数,免疫组化鉴定分化后的细胞,计数分化后的新生神经元比例。结果Oct-4干扰RNA使神经前体细胞Oct-4表达下降约40％,正常未干扰胚胎干细胞分化的神经元为（75．5±5．2）％,GFP组为（73．8±4．7）％,Oct4干扰RNA组为（33．8±2．9）％,与正常组和GFP组比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论采用RNA干扰方法可以有效降低神经前体细胞0ct-4的表达,使分化后新生神经元生成减少,证实了Oct-4基因在胚胎来源神经前体细胞向神经元分化中发挥着重要作用。     

人脐带间充质干细胞对帕金森病患者外周血淋巴细胞增生的抑制

目的：观察人脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSC）对男性健康青年人（25～35岁）、健康中年人（50～60岁）、以及中年帕金森病（ Parkinson’ s disease,PD）患者的外周血单核细胞（ peripheral blood mononuclear cell, PBMC）增生的抑制作用,并探讨引发 UC-MSC 发挥抑制作用所需要的细胞因子。方法用不同组合的细胞因子作用后的 UC-MSC 和 PBMC 共培养,观察 PBMC 增生受抑制的情况。结果不仅健康青年人的 PBMC 增生被 UC-MSC 抑制,健康中年人和中年 PD 患者的淋巴细胞也受到抑制,PD 患者 PBMC 受抑制程度比青年人小,但和同年龄组健康中年人相比差异没有统计学意义;UC-MSC 必须经过肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor,TNFα）、白细胞介素-1α（interleukin-1α,IL-1α）、IL-1β中的一种与干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）联合刺激后才可以发挥抑制作用,“IFN-γ＋IL-1α”和“IFN-γ＋IL-1β”组合刺激 UC-MSC 后对 PBMC 的抑制作用相比“IFN-γ＋TNFα”更强。结论 UC-MSC 对 PBMC 的抑制作用不是自发的,而需要炎性反应因子的刺激,这就提示经过体外炎性反应因子处理的 UC-MSC 可能更适合移植后抗炎性反应治疗的需要;UC-MSC 可以体外抑制 PD 患者 PBMC 增生,至少对于中年患者,帕金森病并没有影响 PBMC 增生对 UC-MSC 抑制作用的反应性,这就为临床实验治疗 PD 提供了一项理论依据。     

大鼠脑梗死后48小时移植入胚胎干细胞的存活和分化

目的 观察小鼠胚胎干细胞,在大鼠脑梗死发生48 h后移植人梗死核心区,是否能够存活并且分化为神经元和胶质细胞.方法 小鼠胚胎干细胞去除滋养层后培养,线栓法制作大鼠大脑中动脉堵塞脑梗死模型,成模48 h后将胚胎干细胞移植入梗死核心区.移植21 d后切片观察.结果 植入的胚胎干细胞可在梗死区的边缘存活,并且大量分化成为神经元和胶质细胞,植入细胞所分化出的神经细胞中,表达NeuN和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的神经元和胶质细胞的比例分别达到(83.0±3.2)%和(22.0±3.6)%.结论 在脑梗死后48 h于核心区植入胚胎干细胞可能成为新的移植方式.     

不同分化阶段的小鼠胚胎干细胞移植到大鼠纹状体后多巴胺能神经元的存活和致瘤性比较分析

目的观察体外不同分化阶段的小鼠胚胎干细胞移植到SD大鼠纹状体后多巴胺能神经元的存活和致瘤性。方法首先将小鼠胚胎干细胞在体外诱导分化，分别将同等数量的诱导分化成神经前体细胞阶段（S4）和多巴胺能神经元阶段（S5）的细胞立体定向移植到两组SD大鼠纹状体内，2周后处死大鼠，免疫组化检测移植细胞的TH阳性细胞率及肿瘤形成率。利用SPSS10．0统计软件进行数据处理和分析。结果分别给两组SD大鼠脑内移植s4和s5阶段的细胞，移植后2周移植例颅内均可见Thy-1阳性细胞并沿针道迁移至移植侧侧脑室及脑实质；S5细胞组大鼠颅内Thy-1阳性细胞中可见到11．018％的酪氨酸羟化酶（TH）FEI性细胞，与S4细胞组相比（6．422％），有明显的差异；S4细胞组有6只大鼠脑切片发现有畸胎瘤形成（60％），S5细胞组有5只大鼠脑切片发现有以原始神经上皮为主要成分的肿瘤形成（50％）。结论移植细胞成活可以继续分化成TH阳性神经元并能在脑内迁移，且越是相对成熟的细胞移植到大鼠纹状体后分化成TH^＋的阳性率越高；体外诱导分化的胚胎干细胞移植后可导致肿瘤形成，其分化程度的不同与肿瘤形成的类型有明显的关系。移植ESC衍生的神经前体细胞以形成畸胎瘤为主，而移植终末分化阶段的细胞以形成原始神经外胚层肿瘤为主。     

小鼠胚胎干细胞移植后两种示踪方法的比较

目的 观察小鼠胚胎干细胞(ES)移植入大鼠脑内后绿色荧光蛋白(GFP)质粒和Thy-1抗体在指示细胞及细胞分化方面的特点.方法 标记方法一:将p-EGFP-N1质粒转入ES细胞,连续10代抗生素筛选表达GFP的GFP-ES,并将GFP-ES移植入活体大鼠脑内.取材后冰冻切片,在荧光显微镜下观察切片上的绿色荧光.标记方法二:直接移植胚胎干细胞后取材,用特异性抗小鼠Thy-1抗体作移植细胞的免疫组织化学染色,荧光显微镜下观察.另外,两种标记方法均做神经元和胶质细胞的特异抗体神经细胞核抗体(NeuN)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组织化学染色,观察是否与GFP或Thy-1抗体双标记,以此判定细胞分化情况.结果 GFP质粒转化后的ES细胞团和单细胞均表达亮绿色的GFP,转化效率为30%;移植21d后,大鼠脑内存活的移植细胞仍表达GFP,但不能和NeuN、GFAP的染色双标记.大量Thy-1阳性的植入细胞和NeuN、GFAP双标记.结论 GFP质粒标记胚胎干细胞后移植可以较好地显示移植细胞,但不能观察细胞分化;而Thy-1抗体不仅在显示移植细胞上有较好的效果,还可以准确地标记分化细胞.     

Bmi-1基因对人胚胎纹状体来源神经干细胞的自我更新和增殖的作用

目的 探讨人类纹状体来源的神经干细胞(NSCs)中,Bmi-1基因是否参与自我更新和增殖的维持. 方法 用human-Bmi-1干扰病毒和绿色荧光蛋白(GFP)对照病毒分别转染NSC,镜下观察转染效率.于转染后0h、48h、72h和168h 4个时间点收集细胞,用实时定量聚合酶链反应检测Bmi-1干扰组与同时间点GFP对照病毒转染组细胞中的Bmi-1基因的相对转录水平,1周后比较human-Bmi-1干扰病毒和GFP对照病毒转染后细胞的克隆形成数和新生神经球直径. 结果 经Bmi-1干扰病毒和GFP对照病毒转染后48h,显微镜下观察见细胞均带有绿色荧光,转染效率超过90%.与转染后0h的Bmi-1基因的相对转录水平(107.3±8.0618)%相比,48h、72h和168h的Bmi-1基因的相对转录水平下降,分别为(32.7±9.74)%、(24.4±12.15)%和(32.7±10.39)%,差异有统计学意义(P<0.05).经Bmi-1干扰后,细胞的克隆形成数和新生神经球直径都显著下降. 结论 Bmi-1基因正向调控人类纹状体来源的NSC的自我更新和增殖,当细胞内的Bmi-1转录水平下降时,细胞的克隆形成数和新生神经球直径也显著下降.     

胚胎干细胞"五步法"体外诱导成为神经细胞的实验观察

目的采用"五步法"将鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)诱导成为神经元和胶质细胞.方法首先将ES细胞接种到铺有明胶的培养瓶里,在无滋养层细胞的情况下生长3 d,然后将细胞悬浮培养4 d成为胚胎体(,胚胎体经过无血清培养基培养6 d,富集nestin阳性细胞,在有丝分裂原bFGF作用下扩增6 d,最后经过烟酰胺诱导分化6 d,共计经过5个步骤.结果诱导出多量表达Tuj-1的不成熟神经元(约占分化后细胞数量的80%～90%)和表达神经胶质纤维酸性蛋白的星形胶质细胞(5%～10%),还有少量表达微管相关蛋白Ⅱ的成熟神经元(5%～10%).结论"五步法"诱导使胚胎干细胞在分化过程中处于不同的阶段,最终诱导出大量不成熟的神经元,少量星型胶质细胞和成熟神经元.为利用不同成熟度的分化细胞移植治疗神经系统疾病提供了充足的细胞来源.