细胞移植在帕金森病治疗中的研究和应用进展

帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病,65岁以上人群发病率超过1%,特征性病理改变是多巴胺神经元凋亡和黑质纹状体通路损害,临床症状表现进展性运动迟缓、僵直和静止性震颤[1].目前病因仍不清楚,早期右旋多巴治疗效果明显,但最终因多巴胺神经元的数量减少而无效.     

p16~(INK4a)/p14~(ARF)基因在细胞衰老和肿瘤抑制中的作用研究进展

细胞衰老发生后细胞在形态和生化成分都发生改变,进而发生生理性功能障碍,最终进入凋亡和死亡程序。细胞衰老是生命体在细胞水平防止永生化和恶变、预防肿瘤发生的一种机制。细胞衰老由多种原因引起,近年来的研究发现,p16INK4a-pRb(视网膜母细胞瘤抗癌蛋白)和p14ARF-p53这2条途径的活化与细胞衰老的启动和调节过程密切相关,对细胞衰老的信号传导通路及其调节因子等方面的深入研究,可以进一步认识细胞增生、衰老进程,以及防治肿瘤的规律,并为衰老相关疾病的治疗提示研究方向。     

胰岛素对心肺复苏大鼠神经元凋亡及Bcl-2,Bax mRNA表达的影响

目的 探讨脑室内注射胰岛素对心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation,CPR)后大鼠海马CA1区神经元凋亡和对抑凋亡因子Bcl-2,促凋亡因子Bax mRNA表达的影响.方法 实验地点在首都医科大学宣武医院试验动物中心.30只雄性SD大鼠随机(随机数字法)分为假手术组(对照组,n=6)、心肺复苏组(复苏组,n=12)及CPR后胰岛素干预组(胰岛素组,n=12).经食道超速起搏诱发6min室颤制备大鼠CPR模型;以CPR后大鼠恢复室上性心率、收缩压超过60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)并持续10 min以上,作为自主循环恢复(ROCS)标准;ROCS 10 min后,胰岛素组大鼠经立体定位仪定位,脑室内注射12.5 μL(1 U)胰岛素,其余2组大鼠注射等量生理盐水.维持生命体征,CPR后24,72 h,应用实时荧光PCR (Realtime-PCR)测定海马CA1区神经元Bcl-2,Bax mRNA的表达量;CPR后7d,应用TUNEL染色检测海马CA1区神经元凋亡;CPR前后监测大鼠静脉血糖变化.计量资料采用均数±标准差(-x±s),组间比较采用单因素方差分析(ANOVA);相关性统计应用Pearson相关分析,以P＜0.05为差异具有统计学意义.结果 ①CPR后24,72 h,胰岛素组大鼠Bcl-2 mRNA表达量均高于复苏组(1.45±0.05) vs.(0.79±0.01);(0.95±0.06) vs.(0.35±0.03),差异具有统计学意义(P＜0.01).组内比较发现,胰岛素组、复苏组72 h表达均低于24 h(P＜0.01).而胰岛素组与复苏组Bax mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05),胰岛素组、复苏组72 h与24h比较差异无统计学意义(P＞0.05).②CPR后7d,胰岛素组大鼠海马CA1区神经元凋亡计数,复苏组(124.75±17.35)个/mm2明显高于对照组(5.12±3.26)个/mm2和胰岛素组(92.79±7.49)个/mm2,差异具有统计学意义(P＜0.01).③各组大鼠各时间点外周静脉血糖比较无统计学意义(P＞0.05).结论 脑室内注射1U胰岛素,能够促进CPR后大鼠神经元促凋亡因子Bcl-2 mRNA的表达,抑制神经元凋亡,具有神经保护作用.脑室注射1U胰岛素不降低外周血糖.     

食蟹猴胚胎干细胞的培养及向神经细胞诱导分化

目的 建立食蟹猴胚胎干细胞系体外培养体系,并诱导其向神经细胞分化,为在体移植实验奠定基础。方法 用小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层,长期培养食蟹猴胚胎干细胞。在无血清培养基中添加小鼠重组Noggin的方式诱导其向神经细胞分化,并对分化各阶段细胞进行免疫组化染色检测分化效果。结果 食蟹猴胚胎干细胞在滋养层上成克隆样生长,可以长期扩增超过20代并保持胚胎干细胞的特性。诱导向神经细胞分化约14d,即可形成呈玫瑰花环样的神经前体细胞结构,可见大量Nestin阳性细胞,及部分Tuj-1阳性细胞;分化约21d时,可见大量Nestin阳性细胞以及大量Tuj-1阳性细胞;分化超过35d,可见GFAP阳性细胞,而Tuj-1阳性细胞减少。结论 成功建立食蟹猴胚胎干细胞的培养体系,在此基础上诱导其分化可获得大量神经前体细胞,尤其是早期神经细胞。     

慢病毒介导绿色荧光蛋白转染人胚胎干细胞及其培养

目的 稳定培养人胚胎干细胞,并通过慢病毒载体对其进行绿色荧光蛋白标记.方法 利用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层或Matrigel作为基质培养人胚胎干细胞,包装带有GFP序列的慢病毒转染人胚胎干细胞.对转染前后的人胚胎干细胞进行了碱性磷酸酶和SSEA-3免疫组化鉴定.结果 在MEF饲养层和Matrigel上均可培养出呈克隆样生长,表达标志抗原的人胚胎干细胞,经慢病毒转染及抗生素筛选后仍可稳定表达GFP.结论 成功地培养了人胚胎干细胞系,并进行了GFP标记.     

血管内皮生长因子基因在人胚胎胰岛干细胞中的表达

目的 构建含血管内皮生长因子(VEGF)基因的慢病毒载体,转染人胚胎来源的胰岛干细胞(hPSC),探讨VEGF在胰岛干细胞中的体外表达水平及其影响因素.方法 将VEGF基因克隆入慢病毒载体,利用293T细胞包装出病毒,按拷贝数分别为2、5、10转染胰岛干细胞,测定不同转染组VEGF的分泌水平.结果 含VEGF的病毒上清可以在体外培养条件下成功转染胰岛干细胞,经潮霉素筛选3 d后,对照组及拷贝数分别为2、5、10的转染组每1×106个细胞每小时VEGF的分泌量分别为(60.3±13.4)、(1622.0±302.0)、(2270.0±340.0)、(3090.0±465.0)ng/L.对照组与转染组间(P＜0.05)以及各转染组之间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 含VEGF的慢病毒载体可以成功转染人胚胎来源的胰岛干细胞,使其持续高表达VEGF,通过改变转染拷贝数可在一定水平上控制VEGF的分泌水平.

Abstract：

Objective To transfect vascular endothelial growth factor (VEGF) gene into human pancreatic stem cells (hPSC) by lentiviral vectors. Methods VEGF gene was sub-cloned into the lentiviral transfer vectors which also encoded hygromycin gene. The recombinant lentiviral vectors were packaged by 293T cells through three plasmids transient co-transfection method using standard lipofectamine reagent.The viral titers were tested by transfecting 293T cells. hPSC were transducted under different multiplicity of infection (MOI). VEGF secretion level was tested by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results Lentiviral vectors encoding VEGF and hygromycin resistance gene were constructed. Using lentiviral vectors encoding VEGF, we successfully transfected hPSC, and the transfected hPSC expressed VEGF continuously. On the day 3 after screening by hygromycin, the content of VEGF secreted by 1 × 106 cells per h was (60. 3 ± 13.4), ( 1622.0 ±302. 0), (2270. 0 ±340. 0), (3090. 0 ±465. 0) ng/L respectively when MOI was 0, 2, 5 and 10. The results indicated that VEGF expression was influenced by MOI ( P ＜ 0. 05 ).Conclusion Lentiviral vectors encoding VEGF and hygromycin resistance gene were constructed and could be used to transfect human pancreatic stem cells successfully.     

胚胎干细胞分化的神经前体细胞移植治疗帕金森病的实验研究

目的探讨胚胎干细胞（embryonic stemcell,ESC）来源的神经前体细胞（Neural precursorcell）移植治疗帕金森病的可能性。方法将胚胎干细胞诱导分化到神经前体细胞阶段后移植到大鼠帕金森病模型纹状体中,并设生理盐水组做对照研究,观察两组移植后行为学改变及检查纹状体内DA、DOPAC的含量。结果移植组在2～4周后与对照组相比行为学上有明显改善（P〈0．01）,纹状体内DA、DOPAC的含量显著提高（P〈0．01）。结论胚胎干细胞经诱导分化成神经前体细胞可用于帕金森病的修复治疗,胚胎干细胞是良好的干细胞移植治疗用细胞来源。     

骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠脑梗死的机制研究

目的 观察炎性因子和营养因子在静脉植入同种异体骨髓间充质干细胞(MSC)治疗大鼠脑梗死中的作用.方法 采用大脑中动脉远端阻塞法(dMCAO)制作大鼠脑梗死模型,假手术组开颅但不凝断血管、移植组于造模后1h经尾静脉移植1×106大鼠骨髓MSC,缺血对照组注射等量生理盐水.移植后48 h取脑用ELISA法检测皮层梗死核心区及纹状体促炎因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6,抗炎因子IL-4、IL-10,以及营养因子IGF-1、GDNF、BDNF的含量.结果 同种异体骨髓MSC移植后48 h,和缺血对照组比较,移植组脑梗死区炎性因子IFN-γ、IL-6显著降低,TNF-α、IL-1β显著升高,纹状体区IL-10显著下降.移植组梗死区BDNF的含量比缺血对照组显著增高,纹状体区IGF-1的含量也比缺血对照组显著升高;GDNF在各组间无显著差异.结论 脑梗死后1h同种异体静脉移植骨髓MSC治疗dMCAO模型,其梗死后48 h时间点的治疗效果和MSC抑制炎性反应没有明确联系,而更可能和大鼠脑内营养性细胞因子增加有关.     

尼龙线直径和硬度对大鼠线栓法脑缺血模型成功率的影响

大鼠线栓法局灶性脑缺血模型栓堵血管是在非直视下进行的,容易发生不缺血或尼龙线刺破颅底动脉造成蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)两种失败的情况.各个实验室多将在成功率和SAH发生率上的差异归因于动物的品系、体重和插入深度上的差异等[1],但对于尼龙线的直径和硬度对模型成功率影响的研究不多见.本研究主要探讨了这两种因素对模型成功率的影响.     

Bmi-1基因对于人胚骨髓间充质干细胞增生和衰老的作用

目的探讨人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)中,Bmi-1(B cell specific moloney murine leukemia virus insertion site1,Bmi-1)基因是否参与了自我更新和增生的维持。方法 用human-Bmi-1干扰病毒和GFP对照病毒分别转染MSC,进行RNA干扰(RNA interference,RNAi),镜下观察转染效率。于转染后0、72、120、168h4个时间点收集细胞,用实时定量PCR(Real-time PCR)方法检测细胞中的Bmi-1干扰组与同时间点GFP对照病毒转染组相比的相对转录水平,一周后比较human-Bmi-1干扰病毒和GFP对照病毒转染后MSC细胞的增生能力和衰老状态。结果 经human-Bmi-1干扰病毒和GFP对照病毒转染后48h,显微镜下细胞都带有绿色荧光,转染效率超过90%。与转染后0h的Bmi-1基因的相对转录水平(100±21)%相比,72、120、168h的Bmi-1基因的相对转录水平下降,分别为:(28±18)%、(55±21)%和(58±22)%,差异有统计学意义。经Bmi-1干扰后,细胞的增生能力显著下降,衰老细胞数量显著增加。结论 Bmi-1基因正性调控人类胚胎骨髓来源的MSC的增生,并防止衰老,当细胞内的Bmi-1转录水平下降时,细胞增生减慢,衰老细胞也显著增加。