NF-κB参与哮喘血清被动致敏的人气道平滑肌细胞中PKCα诱导的Cyclin D1上调及细胞增殖

摘要目的探究蛋白激酶Cα-核因子κB（PKCα-NF-κB）级联对哮喘血清被动致敏的人气道平滑肌细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的调节作用及细胞增殖的影响。方法用10％的哮喘患者血清被动致敏人气道平滑肌细胞（HASMCs）,予以蛋白激酶C（PKC）激活剂12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯（PMA）刺激。分别以PKCα反义寡核苷酸（PKCα as ODN）和吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）抑制PKCα表达和NF-κB活化。用凝胶电泳迁移率改变试验（EMSA）检测HASMCs中NF-κB的活性,用RT-PCR法及Westernblot法检测干预前后CyclinD1的mRNA及蛋白表达水平,用流式细胞术和四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测HASMCs增殖。结果PMA刺激后磷酸化PKCα（P-PKCα）水平增高,NF-κB-DNA结合活性增强,CyclinD1表达明显增强,HASMCs的增殖增强;而反义PKCα寡核苷酸转入细胞特异性地抑制PKCα表达后,p-PKCα水平下降,NF-κB-DNA结合活性明显减弱,CyclinD1表达也明显下降,HASMCs的增殖减弱（P〈0．05,n=4）;用PDTC抑制NF-κB活性后,PMA刺激下p-PKCα水平仍然明显增高,但CyclinD1的表达明显下降,HASMCs的增殖减弱（P〈0．05,n=4）。结论NF-κB是PKCα的下游信号分子,PKCα—NFκB级联参与了PMA所诱导的哮喘血清被动致敏的人气道平滑肌细胞Cyclin D1的表达上调及细胞增殖。     

不同缺氧阶段大鼠肺血管核因子-κB活性的变化及其与缺氧性肺血管重建的关系

目的探讨缺氧不同阶段大鼠整体水平肺血管蛋白激酶C（PKC）和核因子-κB（NF-κB）活性的变化，以及这种变化与缺氧性肺血管重建的关系。方法雄性Wistar大鼠60只，随机分为常氧对照组（C组），缺氧1周组（H1组）、2周组（H2组）、3周组（H3组）和4周组（H4组）。测定肺动脉平均压力（mPAP）、右心室重／（左心室重＋室间隔重）[RV／（LV＋S）]、肺细小动脉管壁面积占管总面积的百分比（WA／TA）。用凝胶电泳迁移率改变试验（EMSA）检测肺动脉NF-κB／DNA结合活性。用Western blot检测肺动脉PKCα胞膜和胞质蛋白质表达。结果①H3组大鼠mPAP、RV／（LV＋S）、WA／TA分别与H2组、H1组及C组相应指标比较差异均有显著性意义（均P〈0．05）；与H4组比较差异无显著性意义（均P〉0．05）。②H1组、H2组、H3组和H4组NF-κB／DNA结合活性明显高于C组，差异均有显著性意义（均P〈0．05）；但H1组、H2组、H3组和H4组组间两两比较差异无显著性意义（均P〉0．05）。③H3组大鼠肺动脉PKCα胞膜蛋白质表达明显增高，PKCα胞质蛋白质表达明显下降，与H2组、H1组及C组比较差异均有显著性意义（均P〈0．05），与H4组比较差异均无显著性意义（P〉0．05）。结论早期缺氧可使NF-κB／DNA结合活性明显增强；缺氧3周大鼠肺动脉PKCα转位活化明显增强。提示不同缺氧阶段大鼠肺血管PKCα和NF-κB活性的变化可能与缺氧性肺血管的重建和肺动脉高压的形成有关。     

Heat Shock Protein 70 Gene Polymorphisms in Han Nationality of China with Chronic Obstructive Pulmonary Diseases

Summary In order to investigate whether polymorphism in gene for heat shock protein 70 (HSP70) has any bearing on individual susceptibility to the development of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), the geotypes of 88 patients with COPD and 87 healthy smoking control subjects were tested by polymerase chain reaction followed by restriction fragment polymorphism analysis for HSP70 gene. In COPD group, HSP70-1 genotype A/A, A/B and B/B was 59. 1%, 35.2% and 5.7%, HSP70-2 genotype A/A, A/B and B/B was 26.1%, 54.6% and 19.3%, and HSP70-hom genotype A/A, A/B and B/B was 70.4%, 27.3% and 2.3% respectively. In the control group, it was 60.9%, 27.5% and 3.5%, 20.7%, 56.3% and 23.0%, and 54.0%, 42.5% and 3.5%, respectively. The frequency of polymorphic genetypes showed no difference between the COPD group and the control group (P>0.05). It was suggested that geneic polymorphism in HSP70 is not associated with development of COPD in Han nationality of China. XIE Jungang, male, born in 1970, M. D., Ph. D. This project was supported by grants from the National Key Technologies R & D Programme of the Tenth Five year Plan [2001 BA 703B03(B)] and the clinical intensive discipline of Ministry of Public Health ([2001]321).     

吸入NO对慢性阻塞性肺疾病患者血流动力学、血气及氧运输功能的影响

观察了11例慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者吸入 40μl/L一氧化氮（NO）前后血流动力学、动脉和混合静脉血气、肺内气体交换、氧运输功能及高铁血红蛋白（MetHb）的变化。结果见吸入 NO 2、8、15 min时,肺动脉平均压（mPAP）分别下降了 21.97％、23.93％和 23.28％,肺血管阻力（PVR）分别下降了33.35％、28.07％和31.09％（均为P<0.01）;停止吸入NO 2 min时,mPAP和PVR恢复至吸入前水平。吸入NO对其余指标无明显影响。提示吸入NO选择性降低COPD患者肺动脉压,且具有速效、不影响血气和氧运输功能等特点。     

核因子κB在蛋白激酶C诱导哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用

目的:探讨核因子κB(NF-κB)在蛋白激酶C(PKC)致哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖中的作用。方法:16只Wistar大鼠随机分为哮喘组(8只)和对照组(8只)。应用PKC激动剂PMA和NF-κB抑制剂PDTC干预哮喘组和对照组大鼠ASMCs。采用流式细胞术、MTT法及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫荧光技术等方法检测ASMCs增殖;免疫荧光技术及电泳迁移率改变分析(EMSA)检测NF-κB活性。结果:PMA干预哮喘组ASMCs后S期细胞比例、A值、PCNA表达率、NF-κBp65阳性率及结合带的灰度值均显著高于未干预的哮喘组ASMCs(均P<0.05),PDTC预处理后再给予PMA上述指标均低于仅用PMA干预及未干预者(均P<0.05)。仅用PDTC处理的哮喘组ASMCs上述指标均低于未干预的ASMCs(均P<0.05)。结论:NF-κB参与哮喘大鼠ASMCs增殖,在其增殖中存在着PKC-NF-κB信号途径。     

香烟提出物对被动吸烟大鼠肺泡巨噬细胞源性明胶酶的表达和酶活性的影响

目的： 探讨香烟烟雾对被动吸烟大鼠肺泡巨噬细胞源性明胶酶A（MMP-2）和明胶酶B（MMP-9）表达及酶活性的影响。 方法： 复制被动吸烟大鼠模型，从其支气管肺泡灌洗液(BALF)中分离与培养大鼠肺泡巨噬细胞（AM），经Giemsa染色法鉴定，以台盼蓝染色计数和检测其活性；制备香烟提出物（CSM），刺激培养的AM。以半定量RT-PCR法检测MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平；以明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9酶活性水平。 结果： 以0%、1%、3%、5%、10%、15%CSM刺激AM时，MMP-9和β-actin mRNA灰密度值比分别为：0.095±0.006、0.215±0.018、0.468±0.038、0.837±0.047、0.159±0.028、0.092±0.002；而MMP-2和β-actin mRNA灰密度值比分别为：0.109±0.023、0.176±0.036、0.317±0.024、0.370±0.051、0.274±0.025、0.087±0.005。MMP-2酶活性的相对灰密度值分别为 6 007.83±147.39、38 202.00±3 160.40、70 532.00±3 225.18、90 074.00±925.62、70 070.17±2 060.33、17 487.67±2 060.33；MMP-9酶活性的相对灰密度值分别为 10 904.67±1 697.00、52 627.83±3 974.05、95 284.83±3 098.89、103 400.50±3 441.30、94 650.33±3 825.08、27 571.17±2 129.48。组间均存在显著差异（P<0.05）。 结论： 香烟烟雾可诱导AM源性MMP-2和MMP-9 mRNA的表达，并导致其酶活性升高；AM及其分泌的明胶酶活性异常可能在吸烟相关的COPD中起重要作用。     

核因子-κB抑制剂在蛋白激酶C对低氧性肺动脉高压大鼠肺动脉环反应性影响中的作用

目的:探讨核因子-κB抑制剂在蛋白激酶C对低氧性肺动脉高压大鼠离体肺动脉环反应性影响中的作用。方法:复制低氧性肺动脉高压大鼠模型,测定肺动脉平均压(mPAP)、右心室重/(左心室+室间隔)重。取低氧模型组和常氧组大鼠的去内皮肺动脉环,观察PKC激活剂PMA0.5μmol/L对肺动脉环的时间-效应曲线以及NF-κB抑制剂PDTC0-1000μmol/L时对PMA诱导肺动脉环反应性改变的浓度-效应曲线。以血管环对10μmol/L盐酸苯肾上腺素的最大反应值为P₀,对PMA和PDTC的反应值以占P₀的百分值表示(%P₀),记录达最大反应值一半时对应的时间t_1/2(min)、峰值持续时间T(min)。结果:低氧组的mPAP及RV/(LV+S)均高于常氧组(P<0.05)。PMA0.5μmol/L作用于血管环:低氧组各时点的张力%P₀均高于常氧组(P<0.05);低氧组t_1/2小于常氧组(P<0.05);低氧组T大于常氧组(P<0.05)。PDTC0-100μmol/L血管环相对张力低氧组均高于常氧组(P<0.05);大于500μmol/L两组血管张力均下降(P<0.05)。结论:低氧可导致去内皮肺动脉环对PMA的反应性增强;PDTC呈剂量依赖性地降低去内皮肺动脉环对PMA的反应性。提示肺动脉平滑肌细胞内PKC－NF-κB生物信号转导途径的变化可能参与低氧性肺动脉高压肺血管反应性异常升高的过程。     

肺泡表面活性物质相关蛋白A基因多态性与慢性阻塞性肺疾病易感性的关系

目的探讨中国汉族人肺泡表面活性物质相关蛋白A(surfactantproteinA,SPA)基因多态性与慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)易感性的关系。方法应用聚合酶链反应及限制性片段长度多态性,检测SPA基因型在88例吸烟COPD患者和87名健康吸烟者中频率的分布。结果88例COPD患者+186位点AA、AG、GG3种基因型的分布频率分别为86.4%、12.5%和1.1%,而对照组为66.7%、27.6%和5.7%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。+655位点CC、CT、TT3种基因型的分布频率分别为65.9%、27.3%和6.8%,而对照组为52.9%、36.8%和10.3%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。+667位点AA、AC、CC3种基因型的分布频率分别为47.2%、43.2%和9.1%;而对照组这三个基因基因型的分布频率分别为35.6%、51.7%和12.6%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论SPA+186位点基因多态性可能与中国汉族人吸烟COPD患者的发病有关,但该位点的突变怎样影响SPA的表达和活性,还有待进一步的研究。     

细胞周期蛋白D1对被动致敏的人气道平滑肌细胞增殖调控的影响

支气管哮喘(以下简称哮喘)的本质是气道慢性炎症,并在此基础上出现气道高反应性和气道重塑;而气道平滑肌增殖在哮喘气道重塑中起重要作用,是不可逆性气流阻塞、持续气道高反应性的重要病理基础.细胞分裂增殖必须经过细胞周期有规律地运行,细胞周期蛋白对细胞周期运行起关键的调控作用.已有研究证实,在人气道平滑肌细胞(HASMC),细胞周期蛋白D1表达增加可促进细胞增殖[1],但有关细胞周期蛋白D1对哮喘HASMC增殖调控的研究目前少见报道.由于哮喘患者的气道平滑肌很难获得,本实验用哮喘血清被动致敏的HASMC[2],观察细胞周期蛋白D1对HASMC增殖的影响,进一步阐明哮喘HASMC的增殖机制.     

Effect of Cigarette Smoke Extract on the Role of Protein Kinase C in the Proliferation of Passively Sensitized Human Airway Smooth Muscle Cells

Cigarette smoke(CS) is ani mportant risk fac-tor involvedin the development and progression ofasthma[1]. Ovalbumin ( Ova) sensitization inducesairway hyperresponsiveness ( AHR) to inhaled CSin guinea pigs[2]. Airway smooth muscle prolifera-tion plays an i mportant role in airway remodelingin asthma . Protein kinase C (PKC) is one of thecrucial kinases in the intracellular signal transduc-tion pathway .CSEcanincrease PKC's activationinhuman bronchial epithelial cells[3].Because airwaysm…