两例TTV感染者不同TTV克隆的DNA序列分析

目的探讨TTV的基因变异及其与致病性的关系。方法在ORF1区的高变区设计特异性引物建立巢式多聚酶链反应（PCR），扩增献血员与慢性非甲-庚型重型肝炎患者血清中的TTV DNA。PCR产物纯化回收后进行分子克隆，每例挑选10个不同TTV DNA克隆进行测序。不同们TTV DNA克隆之间及其与日本株TA278之间进行序列比较并进行进化树分析。结果成功地构建了TTV DNA克隆。与G1a亚型TA278的序列相比较有74％～95％的同源。献血员存在2种不同的TTV病毒株，其序列有7％的差异，都为G1a亚型。慢性非甲-庚型重型肝炎患者中存在7种不同的TTV病毒株，彼此之间序列有5％～24％不同，分别属于G1a和G1b亚型。结论慢性非甲-庚型重型肝炎患者中TTV的基因变异比献血员中的复杂得多。TTV基因变异的复杂性及其基因变异过程中可能产生的强毒力病毒株均有可能在其致病机制中起一定作用。G1b亚型可能有一定的致病性。     

复方甘草酸苷治疗慢性重型乙型肝炎的临床研究

目的 研究复方甘草酸苷治疗慢性重型乙型肝炎的临床疗效.方法 100例慢性重型乙型肝炎患者,随机分为两组,对照组采用综合治疗,治疗组在综合治疗基础上加用复方甘草酸苷160mg/d加入10%的葡萄糖250 mL溶液中静脉滴注,疗程1个月.所有患者在治疗前后检测肝功能、PTA和腹水的深度以及血清TNF-α、IL-8、IL-10、K 及Na 水平.结果 治疗组的好转率显著高于对照组(78%vs 64%,P<0.05),AST、ALT、TBIL显著低于对照组,而PTA显著高于对照组(P<0.05);治疗组TNF-α、IL-8水平较对照组下降明显(P<0.01),IL-10明显高于对照组(P<0.01);血清K 和Na 的水平两组治疗前后差异均无显著性;治疗组未见明显的腹水增加.结论 复方甘草酸苷可提高慢性重型肝炎患者的好转率,显著降低血清中TNF-α、IL-8水平和提高IL-10水平.     

熔点曲线法研究TTV肝炎患者中TTV准种与其临床分型的关系

目的研究TTV肝炎患者中TTV准种及其与患者不同临床分型的关系。方法采用巢式荧光实时多聚酶链式反应(PCR)扩增TTVDNA,收集TTV DNA阳性的慢性肝炎病例52例,其中轻度、中度、重度分别为15例、17例、20例;慢性重型肝炎患者18例;献血员15例。采用熔点曲线方法进行TTV准种检测。结果TTV肝炎患者中度、重度和重型组中熔点曲线波峰数量显著多于献血员和慢性TTV肝炎轻度组(P<0.05),重度和重型组熔点曲线波峰数量显著多于中度组患者(P<0.05)。但重度组患者TTVDNA熔点曲线波峰数量与重型组相比较无显著差异(P>0.05)。结论TTV存在病毒准种,TTV准种感染的复杂性可能是TTV肝炎患者病情严重程度有关,准种越复杂病情越严重。     

膦甲酸钠治疗慢性重型乙型肝炎的临床观察

目的探讨膦甲酸钠治疗慢性重型乙型肝炎的疗效及其不良反应。方法选择慢性重型乙型肝炎患者80例，将其随机分为2组，对照组40例仅给予常规护肝及支持治疗，治疗组40例在常规护肝及支持治疗的基础上加用膦甲酸钠3．0g静滴，疗程4周，治疗前后检测肝功能、凝血酶原活动度、乙型肝炎病毒复制标志物HBV DNA和HBeAg，同时观察患者的症状、体征的变化及药物的不良反应。结果HBeAg滴度、HBV DNA拷贝数下降水平治疗组明显高于对照组，差异有显著性（P〈0．05）；HBeAg、HBV DNA的转阴率治疗组明显高于对照组，差异有显著性（P〈0．05）。治疗结束后AST、ALT、TBil治疗组明显低于对照组，差异有显著性（P〈0．05），PTA上升治疗组明显高于对照组，差异也有显著性（P〈0．05）。病死率治疗组明显低于对照组，差异有显著性（P〈0．05）。膦甲酸钠的不良反应主要是轻度的胃肠道反应。结论膦甲酸钠对乙型肝炎病毒有确切的抑制作用，对慢性重型乙型肝炎的治疗具有促进肝功能恢复，降低病死率等优点，膦甲酸钠无明显的不良反应，耐受性较好。     

利拉鲁肽调节2 型糖尿病大鼠肝脏 脂质沉积的机制探讨

目的 探讨利拉鲁肽调节2 型糖尿病（T2DM）大鼠肝脏脂质沉积的机制。方法 采用高脂饮 食联合链脲佐菌素诱导复制T2DM 大鼠模型,随机分组为糖尿病组、利拉鲁肽组、对照组,每组10 只。通 过肝脏形态学检测观察大鼠肝细胞脂质沉积改善情况;血液学检测观察血清脂联素水平的变化;Western blot 检测肝脏AMPK、Thr172p-AMPK、SREBP1 蛋白表达水平的变化。结果 糖尿病组大鼠较对照组大鼠肝细 胞脂质沉积增多（P <0.05）,经利拉鲁肽治疗后肝细胞脂质沉积减小（P <0.05）;与对照组比较,糖尿病组血 清脂联素水平升高（P <0.05）。与对照组比较,糖尿病组大鼠肝脏Thr172p-AMPK/AMPK 降低（P <0.05）, SREBP-1c 表达水平升高（P <0.05）。利拉鲁肽治疗后,Thr172p-AMPK/AMPK 升高（P <0.05）,SREBP-1c 表达水平降低（P <0.05）。结论 利拉鲁肽可通过抑制脂质合成,进而改善T2DM 大鼠的肝脏脂质沉积。     

HCVIRES调控外分泌性碱性磷酸酶基因在肝细胞中的表达

目的 :构建HCVIRES调控外分泌性碱性磷酸酶 (SEAP)基因表达的细胞模型。方法 :用PCR技术扩增HCV 5′NCR片段 ,定向克隆至表达质粒 pSEAP2 Control的SEAP基因上游 ,构建HCV 5′NCR调控SEAP表达的重组质粒 pdNCRSEAP。用脂质体基因转染技术 ,将pdNCRSEAP转染至肝细胞株QSG770 1。用化学发光法检测SEAP的表达 ,并观察不同浓度反义寡聚核苷酸 (ASODN)对SEAP表达的影响。结果 :重组质粒 pdNCRSEAP表达的发光强度为pSEAP2 Control的 76 %,5 μmol和 10 μmolASODN对pdNCRSEAP发光强度的抑制率分别为2 9.2 %和 44 .6 %,而对 pSEAP2 Control的SEAP表达无显著抑制作用 (P >0 .0 5 )结论 :重组质粒 pdNCRSEAP的SEAP表达受HCV 5′NCR调控 ,为以HCV 5′NCR为靶位点的药物评价建立了检测方便的细胞模型。     

熔点曲线法研究乙型肝炎病毒准种和临床表现的关系

目的研究乙型肝炎病毒（HBV）准种与临床的关系，从HBV准种这个角度阐述相同基因型HBV导致不同病情的机制。方法选取B基因型HBV感染的慢性携带者血清32份和慢性乙型肝炎重度患者血清28份作为检测对象，采用熔点曲线法比较两组血清波峰数量的差异。结果慢性乙型肝炎重度患者血清的波峰数量明显多于慢性携带者血清（P〈0．05），提示前者所携带HBV的准种数量多于后者。结论HBV准种与乙型肝炎临床表现存在一定关系，在HBV基因型相同时，病情较重的乙型肝炎与HBV准种数量多有关，可在一定程度上解释同一基因型的不同患者出现不同临床表现的现象。     

人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因真核表达载体的构建

目的构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因(sTNFR1)的真核表达载体,为进一步研究打下基础。方法以Hela细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增人sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pCDNA3.1(-)重组质粒亚克隆,并用酶切分析和序列测定进行鉴定。结果经酶切鉴定和测序证实,人sTNFR1基因被正确克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-)。结论真核表达质粒pCDNA3.1(-)-sTNFR1的构建为今后的研究打下了基础。     

人工肝支持系统对重型肝炎血清PCT水平及临床转归的影响

目的通过观察人工肝支持系统对重型肝炎血清降钙素原（PCT）水平支持系统治疗的重型肝炎患者（第一组）及35例未行人工肝支的影响，探讨PCT水平改变对重型肝炎临床转归的影响。方法测定46例经人工肝持系统治疗（仅行基础治疗）的重型肝炎患者（第二组）治疗前后、39例慢性乙型肝炎患者（第三组，即对照组）血清PCT水平，并对结果进行统计分析。结果3组患者治疗前均检测了PCT，PCT阳性率：第一组为91．30％，第二组为85．71％，第三组为7．69％；第一组与第二组比较，差异无显著性（x^2=1．89，P〉0．05）；第一组、第二组分别与第三组比较，差异均有显著性（x^2分别为6．82与5．89，P均为0．01）。第一组经人工肝支持系统治疗后PCT阳性率为54．35％，与治疗前91．30％比较，差异有显著性（x^2=4．82，P〈0．05）。治疗好转率：第一组为54．35％，第二组为40．00％，两组比较，差异有显著性（x^2=3．87，P〈0．05）；两组好转患者PCT阳性率分别为24．00％、21．43％，差异无显著性（x^2=2．65，P〉0．05）。结论人工肝支持系统治疗能降低重型肝炎患者PCT水平，PCT可以作为观察重型肝炎治疗效果的指标之一。     

微小RNA在HBx缺失突变体致肝细胞增殖中的作用及其机制

目的 研究微小RNA (miRNA)在HBx缺失突变体致人肝细胞异常增殖中的作用及其相关机制. 方法 利用miRNA芯片技术检测稳定表达HBx-d382及HBx的L02(即分别含HBx基因缺失突变体HBx-d382及野生型HBx基因)细胞系中miRNA的表达,实时荧光定量PCR对上述miRNA进行验证.选取在L02/HBx-d382和L02/HBx细胞中均表达明显下调的两个miRNA:miR-338-3P、miR-551b进行功能研究,分为实验组(转染miRNA模拟物组)、阴性对照组(NC,转染miRNA阴性对照)及脂质体组(lipo,单加转染试剂),通过脂质体转染到细胞中,四甲基偶氮唑盐法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞周期,实时荧光定量PCR和Wstern blot检测细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白G1和E2F转录因子的改变.采用SPSS 16.0统计软件,数据均进行了正态检验并符合正态性,组间均数比较采用成组t检验. 结果 (1)与L02/pcDNA3.0细胞比较,L02/HBx-d382细胞有6个miRNA表达上调,5个miRNA表达下调; L02/HBx细胞有4个miRNA表达上调,12个miRNA表达下调.实时荧光定量PCR验证的结果与芯片相一致.(2)转染了miR-338-31p-模拟物和miR-551b-模拟物后,L02/HBx-d382及L02/HBx细胞增殖均受抑制,细胞周期均阻滞在G1期,细胞增殖能力减弱.L02/HBx-d382细胞中,细胞增殖能力:lipo组、NC组、miR-338-3p组和miR-551b组分别为90.0％±1.3％、88.0％±1.6％、56.0％±6.1％和62.0％±6.4％,miR-338-3p组与:lipo组、NC组比较,t值分别为10.402、9.133 ;miR-551b组和与lipo组、NC组比较,t值分别为8.763、7.403,P值均＜0.01.L02/HBx细胞中,细胞增殖能力:lipo组、NC组、miR-338-3p组和miR-551b组分别为91.0％±1.7％、89.0％±2.1％、60.0％±7.7％和66.0％±9.3％,miR-338-3p组与lipo组、NC组比较,t值分别为9.105、8.074;miR-551b组与lipo组、NC组比较,t值分别为7.673、7.52,P值均＜0.01.实时荧光定量PCR检测结果显示细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白G1和E2F转录因子的mRNA水平均无明显改变,但Western blot法发现上述基因的蛋白表达均明显下调,差异有统计学意义. 结论 ①HBx及其缺失突变体能影响L02细胞的miRNA表达谱;②在L02/HBx-d382细胞中下调更明显的miR-338-3p和miR-551b可能通过调控细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白G1和E2F转录因子的表达而调节了细胞的生长.