悬浮阵列技术在研究与临床中的应用

悬浮阵列技术是一种以荧光编码微球为核心,集流式细胞、激光分析、高速数字信号处理等多种技术于一体的多指标并行分析技术平台,可一次同时准确定量检测100种不同的生物分子;具有高通量、高灵敏度,并行检测等特点;常用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体、配体识别分析等研究.     

细胞内细胞因子——自身免疫性疾病的新视野

自身免疫是机体免疫系统对自身抗原发生免疫应答，产生自身抗体和（或）自身致敏淋巴细胞的一种现象，其对一定条件下机体免疫系统的正常自稳性调节具重要意义。当自身免疫异常时，自身抗体和（或）自身反应性淋巴细胞会攻击表达靶抗原的组织或器官，引起自身免疫性疾病（AID）。至今已有30余种疾病被列为AID，但对AID的病因和发病机制尚不清楚，一般认为，主要是各种内外因素打破机体免疫系统的自身耐受，通过自身过度免疫应答引起组织或器官损伤。这些因素可能包括机体内在因素（如遗传背景、自身抗原发生改变等）和外在因素（如发生各种病原微生物感染；超抗原或非特异性T、B细胞多克隆刺激剂作用等）。随着分子生物学和免疫学技术的飞速发展，对AID研究日益深入。特别是近年新技术的应用、新的特异性标志物的发现、发病免疫机理的深入探讨、新的靶分子或位点的寻找都为AID研究带来了新契机，同时也有利于改进和提高AID临床诊断和治疗。对AID的临床特征、实验室诊断技术和诊断指标进展见参考文献，在此仅重点阐述近几年与AID密切相关的细胞内细胞因子（Intracellular cytokine，ICK）的研究。     

定量RT-PCR检测PBC患者外周血中颗粒溶素的基因表达水平

目的建立检测人颗粒溶素(granulysin,GNLY)mRNA含量的实时荧光定量RT-PCR的方法,并测定PBC患者外周血单个核细胞(PBMC)中GNLY的基因表达水平,探讨GNLY基因表达水平与原发性胆汁性肝硬化(PBC,primarybiliary cirrhosis)发生发展的关系。方法基于TaqMan荧光探针技术,构建质粒pET28a-GNLY,作为定量模板,建立实时荧光定量RT-PCR方法。用此方法测定了60例PBC、60例乙型肝炎肝硬化及60例健康对照者外周血中GNLY mRNA的含量。结果PBC患者GNLY mRNA的表达范围为5.35×107-4.61×109拷贝/μg RNA;健康对照者为9.28×105-7.32×107拷贝/μg RNA。PBC组GNLY mRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组(P<0.01)和疾病对照乙型肝炎肝硬化组(P<0.001)。结论成功建立了人GNLY基因表达含量的荧光定量检测方法,PBC患者GNLY mRNA的含量显著高于健康对照组,GNLY表达与PBC的发生发展存在一定的关联性。     

M2抗体重组人源靶抗原二联体在原发性胆汁性肝硬化患者中的检测及应用

目的 利用重组抗原BCOADA-E2和PDC-E2的二联体（BP），检测PBC患者血清中的M2抗体并探讨其临床意义。方法 经Ni—NTA亲和柱纯化重组表达的BP融合蛋白，分别建立免疫印迹法（IBT）和酶链免疫吸附（ELISA）法检测60份PBC患者血清，以60份其他肝病患者、60份自身免疫病患者、80例正常人血清为对照组。结果 经常规试剂盒检测为M2（＋）的60份患者血清，利用重组抗原检测阳性53例，阴性7例，阳性率为88．3％；经常规试剂盒检测为M2（-）的60份自身免疫病患者血清、60份其他肝病患者和80例正常人血清，利用重组抗原检测为M2（-）。结论 利用重组抗原BP检测M2抗体敏感性较高。对临床辅助诊断PBC提供一定的手段。     

RNA干扰SOCS1对线粒体M2蛋白作用树突状细胞功能的影响

目的探讨细胞因子信号转导抑制分子1(SOCS1)干扰后,线粒体M2蛋白对外周血单个核细胞(PB-MC)来源的树突状细胞(DC)功能的影响。方法诱导和培养健康人PBMC来源DC,小干扰RNA(siRNA)抑制SOCS1的表达,用不同浓度的M2蛋白刺激DC,用流式细胞术(FCM)分析DC表型CD83、CD86的表达,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测DC培养上清液中白细胞介素10(IL-10)和白细胞介素12(IL-12)的变化。结果DC在M2蛋白浓度为70μg/mL刺激24 h,35μg/mL刺激24、48和72 h时,与对照组比较,CD83和CD86的表达率以及IL-10和IL-12的水平均明显升高(P<0.05)。M2蛋白刺激SOCS1干扰后的DC,在不同刺激浓度和作用时间,CD83和CD86表达率以及IL-12水平与单纯M2蛋白刺激组相比均明显升高(P<0.05),而IL-10水平在两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 DC在接受高浓度的M2蛋白刺激后,其成熟度、抗原递呈和Th1的极化能力增强;抑制SOCS1的表达,M2蛋白可进一步促进DC功能的增强,可能导致自身耐受的破坏。     

自身免疫病患者外周血中B细胞激活因子基因表达水平的测定

目的　建立测定B细胞激活因子 (B lymphocytestimulator ,BlyS)mRNA含量的荧光定量反转录 聚合酶链反应 (RT PCR)法 ,并用来检测自身免疫病 [系统性红斑狼疮 (SLE)、类风湿关节炎 (RA) ]患者外周血单个核细胞 (PBMCs)中BlyS的基因表达水平 ,探讨BlyS基因表达水平与自身免疫性疾病发病机制的关系。方法　构建克隆载体 pMD18 T BlyS作为定量模板 ,基于TaqMan荧光探针技术 ,建立实时荧光RT PCR方法在GeneAmp 5 70 0型检测仪上定量检测 19例自身免疫病(SLE、RA)确诊病人、2 0例亚临床病人 (主要是抗核抗体阳性 )、8例其他对照性疾病患者 (自身抗体阴性 ,免疫球蛋白升高 )、2 0名正常健康献血者的外周血BlySmRNA表达含量。结果　 19例自身免疫病确诊病人的PBMCs中均有BlySmRNA的表达 ,范围从 9 7× 10 5～ 3 2× 10 8拷贝 /μgRNA ,均值为 (8 4± 7 9)× 10 7拷贝 /μgRNA ;2 0例亚临床病人的强度为 8 6× 10 4～ 3 8× 10 6拷贝 /μgRNA ,均值为 (1 3± 1 2 )× 10 6拷贝 /μgRNA ;2 0名正常健康人的强度为 5 5× 10 4～ 4 9× 10 5拷贝 /μgRNA ,均值为 (1 7± 1 4 )× 10 5拷贝 /μgRNA ;8例自身抗体阴性而免疫球蛋白升高的其他疾病患者的强度为 5 8× 10 5～ 3 5× 10 7拷贝 /μgRNA ,均值为 (1 2±     

TRAIL及其受体与隐球菌性脑膜炎的关联性研究

目的研究建立实时荧光定量（RFQ）-PCR法测定TRAIL及其受体DeR1、DcR2、DR4、DR5 mRNA含量的方法，探讨其在隐球菌性脑膜炎患者外周血单个核细胞中表达的检测价值，并分析隐球菌性脑膜炎患者细胞因子与TRAIL及其受体的相关性。方法设计特异性的引物和探针，以人基因GAPDH为内参照，用实时定量PCR的方法检测35例健康人和35例隐球菌性脑膜炎患者外周血单个核细胞中TRAIL及其受体mRNA的表达水平，采用ELISA方法检测血清IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ浓度。结果与健康人比较，隐球菌性脑膜炎患者外周血单个核细胞中TRAIL mRNA的表达明显下降（P〈0．01）；受体DeR1 mRNA的表达显著升高（P〈0．01），受体DeR2、DR4、DR5 mRNA的变化无统计学意义。隐脑患者血清中IL-10显著升高（P〈0．01），与TRAIL的变化成负相关；IFN-γ显著下降（P〈0．01），与TRAIL的变化成正相关。结论隐球菌性脑膜炎患者TRAIL下降及其受体DeR1mRNA的表达明显升高，提示TRAIL及其受体DeR1可能参与隐球菌性脑膜炎的疾病进程，这为有效治疗隐球菌性脑膜炎提供了新的线索。     

原发性胆汁性肝硬化患者外周血CD4^＋CD25^＋T细胞的定量及其功能分析

目的检测原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者外周血CD4^＋CD25^＋免疫调节性T细胞（Tregs）数量及其对T效应细胞（Treps）增殖的抑制作用。方法流式细胞仪定量检测PBC患者及对照组外周血中Tregs细胞百分比。统计无症状期、症状期、肝硬化期3组患者Tregs细胞百分比。免疫磁珠分离Tregs，检测CD62L、T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（GITR）的表达。体外细胞培养，^3H-胸腺嘧啶掺入法测定Tregs对Treps的免疫抑制功能。结果PBC患者外周血CD4^＋T细胞中的Tregs[3．63±0．92）％]明显低于健康对照组[（7．42±1．09）％，P〈0．01）]。无症状期、症状期、肝硬化期各组Tregs细胞分别为（3．93±0．71）％、（3．64±0．83）％、（3．52±0．95）％，均明显低于健康对照组，但3组之间差异无统计学意义。Tregs细胞高表达CD62L、CTLA-4、GITR分子。PBC患者Treps的体外增殖可以被自身Tregs所抑制，1：1、1：2、1：4、0：1的比例平均抑制率分别为（78．2±4．9）％、（51．6±7．1）％、（21．7±5．6）％、0，健康对照分别为（75．1±5．3）％、（54．5±6．4）％、（27．6±6．3）％、0，两组相比差异无统计学意义。结论PBC患者Tregs数量的降低可能是PBC的致病机制之一。     

实时荧光定量PCR测定人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因表达

目的 建立检测人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因表达含量的实时荧光定量逆转录(FQ-RT)-PCR法,探讨其在健康对照者、乙型病毒性肝炎肝硬化患者及原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达状况.方法 设计TRAIL基因的特异性引物和TaqMan-MGB探针,以β-actin基因为内参,RT-PCR扩增目的 片段.胶同收纯化目的 片段,构建克隆载体作为定最模板,在ABI Prism7000型荧光定量分析仪上进行扩增,建立标准曲线;同时检测30名健康对照者、30例PBC患者及25例乙型病毒性肝炎肝硬化患者外周血PBMC中TRAIL基因的荧光强度和循环阈值,计算样本中TRAIL基因的起始拷贝数.结果 FQ-RT-PCR检测TRAIL mRNA的线性范围为103-106拷贝/ug RNA(r=-0.997);高浓度样本批内和批间变异系数(CV)分别为5.6%和6.3%.低浓度样本批内及批间CV分别为12.5%和14.6%.PBC患者TRAIL mRNA表达量为[(3.3±2.5)×105拷贝ug RNA],高于健康对照组[(0.5±0.2)×105拷贝/ug RNA],两组差异有统计学意义(t=5.994,P<0.01);乙型病毒性肝炎肝硬化患者TRAIL mRNA的表达[(2.1±0.9)×105拷贝/ug RNA]亦高于健康对照组,且差异有统计学意义(t=8.536,P<0.01),而两疾病组间差异无统计学意义(t=1.988,P>0.05).结论 成功建立检测TRAIL mRNA的FQ-RT-PCR法,并初步发现TRAIL mRNA在PBC及乙型病毒性肝炎肝硬化患者外周血PBMC中表达升高,这将对肝硬化肝损伤机制研究提供新的思路.     

隐球菌抗原MP98的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定

目的鉴定隐球菌抗原MP98中的HLA-A＊0201限制性CD8＋CTL表住。方法应用数据库SYFPEITHI预测隐球菌MP98中可能存在的HLA-A＊0201限制性CD8＋CTL表位，经流式细胞术分析各抗原肽与HLA-A＊0201的亲合力，经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞（PBMCs）对各抗原肽产生的增殖反应，经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性T细胞的细胞毒杀伤活性，逐步鉴定MP98的HLA-A＊0201限制性CD8＋CTL表位。结果位于MP98氨基酸序列肽5（436-444aa）与HLA-A＊0201分子具有较高的亲合力，并都能刺激HLA-A＊0201阳性个体者PBMC增殖，并诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL。结论肽5GMFDGLSGV（436-444aa）是MP98上HLA-A＊0201限制性CD8＋CTL的优势表位，可作为隐球菌疫苗设计的候选表位。