颗粒溶素的表达纯化及生物学活性分析

目的:采用原核表达系统对颗粒溶素(granulysin,GNLY)进行体外表达,纯化及活性鉴定.方法:以体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)为模板,RT-PCR扩增编码GNLY的cDNA片段,插入pMD-18-T 载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a( ) 中,构建重组表达质粒pET28a( )-GNLY,转化大肠杆菌BL21(DE3) plysS,IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体经变复性后用Ni亲和层析纯化,CFU法测定蛋白活性.结果:成功地将GNLY cDNA片段插入载体pET28a( )中,构建了表达质粒pET28a( )-GNLY.经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为9 000的融合蛋白,变复性纯化后的GNLY蛋白经CFU法检测,发现其具有细胞毒活性且细胞毒作用具有剂量依赖性.结论:本实验利用原核表达系统成功地表达了具有生物学活性的GNLY,为研究其功能、作用机制及临床应用奠定了基础.     

人TACI-linker-BR3双受体融合基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建人双受体融合基因真核表达载体--pcDNA3.1( )-TACI-linker-BR3-IgGFc,观察其在COS-7细胞中的表达.方法:应用基因工程技术构建重组载体,脂质体转染COS-7细胞,通过Western印迹、ELISA以及免疫组化方法,检测目的蛋白的表达及其与BAFF、APRIL蛋白相互作用情况.结果:融合基因在瞬时转染的真核细胞中获得表达,并分泌至上清,转染效率能达到48%,融合蛋白能与BAFF、APRIL蛋白有效结合而且融合蛋白中分子标签IgGFc未影响双受体融合蛋白的结构及其生物学活性.结论:人TACI-linker-BR3双受体基因与IgGFc融合基因载体构建成功,表达的融合蛋白具有生物学活性,为进一步探讨SLE等自身免疫疾病的发病机制和生物学治疗方法奠定了基础.     

M2抗体人源靶抗原三联体的克隆表达及其在原发性胆汁性肝硬化中的应用

目的 设计克隆表达抗原蛋白三联体BPO，利用纯化的重组BPO，建立原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)特异性免疫学诊断方法。方法 利用基因工程方法克隆表达M2抗原及其三联体BP0，并加以鉴定。纯化BPO，建立ELISA法。应用ELISA法检测17例PBC患血清M2抗体，以167例非PBC患和1225例健康人作对照。结果 17例临床诊断为PBC的患，M2抗体均为阳性，而对照组M2抗体均为阴性。结论 本法检测M2抗体有较好的敏感性及特异性，为PBC的临床诊断提供了有效手段。     

氧化型低密度脂蛋白对单核细胞Toll样受体4表达的影响

血清中高浓度的低密度脂蛋白是冠心病的主要危险因子，而氧化型低密度脂蛋白（OX—LDL）比其天然形式的致动脉粥样硬化作用更强。Toll样受体4（TLR4）与动脉粥样硬化的发生发展密切相关，在粥样斑块组织特别是在脂质丰富、巨噬细胞浸润的部位显著表达和活化。TLR4启动的胞内信号转导最终能激活核因子kappa B（NF—κB），诱导单核／巨噬细胞产生免疫炎性细胞因子、共刺激分子以及黏附分子等。[第一段]     

免疫监测研究与应用中值得关注的几个问题

免疫监测是免疫检验中的重要组成部分,包含从细胞到生物分子等多种指标.在此重点讨论3个问题:首先,T淋巴细胞是所有免疫应答的中心环节,对其进行检测,对了解免疫相关疾病非常重要.在临床检验中应根据实验室条件(如流式细胞仪)和检测目的 (如抗原特异性T淋巴细胞数量或功能)选择不同方法.其次,自身抗体是诊断自身免疫性疾病的重要指标;有些自身抗体甚至可预测疾病的发生,越来越多研究表明,肿瘤患者中存在多种自身抗体,这些自身抗体有可能对肿瘤诊断、治疗肿瘤靶分子的筛选提供帮助.另外,检测细胞因子是了解疾病免疫学机制的重要途径;细胞因子检测有助于判断疾病活动程度,但不具有器官或组织特异性;应加强细胞因子检测的质量控制,以提高其在临床检验中的应用质量.     

肿瘤患者定量检测D-二聚体的临床意义

已有研究表明,恶性肿瘤患者具有发生静脉血栓的高风险性。比如,需要长期抗凝治疗、伴有出血危险、静脉血栓反复发生等,而且出现静脉血栓可能预示患者的高死亡率[1-3]。这种静脉血栓的形成与恶性肿瘤患者存在明显的止凝血功能紊乱、纤溶亢进及血小板活化有关[4]。     

RNA干扰SOCS1对线粒体M2蛋白作用树突状细胞功能的影响

目的探讨细胞因子信号转导抑制分子1(SOCS1)干扰后,线粒体M2蛋白对外周血单个核细胞(PB-MC)来源的树突状细胞(DC)功能的影响。方法诱导和培养健康人PBMC来源DC,小干扰RNA(siRNA)抑制SOCS1的表达,用不同浓度的M2蛋白刺激DC,用流式细胞术(FCM)分析DC表型CD83、CD86的表达,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测DC培养上清液中白细胞介素10(IL-10)和白细胞介素12(IL-12)的变化。结果DC在M2蛋白浓度为70μg/mL刺激24 h,35μg/mL刺激24、48和72 h时,与对照组比较,CD83和CD86的表达率以及IL-10和IL-12的水平均明显升高(P<0.05)。M2蛋白刺激SOCS1干扰后的DC,在不同刺激浓度和作用时间,CD83和CD86表达率以及IL-12水平与单纯M2蛋白刺激组相比均明显升高(P<0.05),而IL-10水平在两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 DC在接受高浓度的M2蛋白刺激后,其成熟度、抗原递呈和Th1的极化能力增强;抑制SOCS1的表达,M2蛋白可进一步促进DC功能的增强,可能导致自身耐受的破坏。     

聚肌苷酸胞苷酸诱导C57小鼠产生抗核抗体和抗线粒体抗体

目的:探讨聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid,polyI:C)注射C57小鼠对其自身抗体产生的影响.方法:50只6～8周龄雌性C57小鼠随机分为药物组和阴性对照组(n=25),药物组按5 mg/kg剂量腹腔注射polyI:C,每周注射2次,阴性对照组注射等量PBS,每4周每组取5只小鼠眼眶采血,间接免疫荧光法测定血清抗核抗体(ANA)和抗线粒体抗体(AMA)水平.结果:随着药物注射次数的增多,药物组在第8周ANA阳性率达到100%,最高滴度达到1:10 000,阴性对照组随着饲养时间的延长也出现ANA阳性,并且在12周达到100%,但是始终没有出现滴度为1:10 000的高滴度自身抗体;随着药物注射次数的增多,药物组血清AMA阳性率逐渐增高,16周达到80%,最高滴度达到1:10 000,对照组未出现AMA阳性.结论: polyI:C注射C57小鼠可以刺激机体产生自身抗体ANA和AMA,并且其对AMA的诱导具有特异性.     

雷公藤甲素对体内外诱生TNF和IL-6的影响

目的：观察雷公藤甲素（Ｔ１０）对肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）、白细胞介素６（ＩＬ－６）在平滑肌细胞（ＳＭＣ）、腹腔巨细胞（ＭΦ）的分渥以及在小鼠体内诱生的影响。方法;体外主动脉ＳＭＣ培养,腹腔注射给药及眼球摘除取血,细胞毒结晶紫染色法测定ＴＮＦ,依赖细胞株ＭＴＴ比色法测定ＩＬ－６。结果：Ｔ１０注射浓度（０～０３７５ｍｇ／ｋｇ）与小鼠血清ＴＮＦ,ＩＬ－６水平呈显著负相关（Ｐ〈０．０１）,腹腔Ｍ培养上清中Ｔ     

应用微流控电泳联合检测载脂蛋白C3基因型

目的 建立应用微流控电泳联合检测载脂蛋白C3(APOC3)启动子区2种基因型的方法.方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增APOC3基因启动子区包含T-455C和C-482T多态性在内的DNA片段,产物分别用限制性内切酶BseGⅠ和MspⅠ酶切后同时进行微流控电泳,分析APOC3基因启动子区这2位点的基因型.结果 成功联合检测APOC3启动子区C-482T和T-455C多态性基因型.结论 应用微流控电泳联合检测APOC3启动子区2位点基因型方法可行,适合应用于常规实验或科研工作.