Wnt信号通路在HepG2细胞株及其克隆形成细胞中表达的异质性

目的:研究Wnt信号传导通路的关键因子β-catenin和COX-2在肝癌细胞株HepG2及其克隆形成细胞中的表达,探讨Wnt信号传导通路在不同增殖能力细胞中表达的异质性.方法:以HepG2细胞为研究对象,采用软琼脂克隆形成实验筛选克隆形成细胞,应用RTPCR、免疫化学和Western blot等技术,检测Wnt信号传...     

N-乙酰-L-色氨酸具有对新生鼠脑缺血/缺氧损伤的保护作用 

目的 探讨N-乙酰-L-色氨酸(L-NAT)对新生鼠脑缺血/缺氧损伤的保护作用.方法 出生第7天的沙土鼠90只,随机分为正常对照组、缺血/缺氧组和L-NAT组.制备脑缺血/缺氧损伤模型,L-NAT组在造模前30min腹腔注射L-NAT(5mg/kg).用Fluoro-Jade B(FJB)染色法观察细胞的死亡情况;用免疫荧光染色、Western blotting观察活化的Caspase-3和Caspase-9在各组的表达.结果 L-NAT可使缺血/缺氧损伤后FJB阳性细胞数量减少,并抑制缺血/缺氧后Caspase-3和Caspase-9的活化.结论 L-NAT对新生鼠脑缺血/缺氧损伤动物模型具有保护作用.     

N-乙酰-L-色氨酸对大鼠肝脏缺血再灌注后肠损伤的保护作用

目的 探讨N-乙酰-L-色氨酸(L-NAT)对大鼠肝脏缺血再灌注中肠损伤的保护作用.方法 将健康成年雄性SD大鼠24只分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(IR组)和缺血再灌注加L-NAT组(IR+ L-NAT组).用夹闭肝中叶和左叶肝蒂分支的方法制作肝缺血再灌注模型,用苏木素-伊红(HE)染色法观察小肠组织的形态学结构,用免疫组织化学染色观察激活型Caspase-3、Bax、Bcl-2的表达.结果 (1)IR组小肠绒毛结构破坏,肠黏膜充血脱落,上皮细胞变性坏死,出现炎症细胞浸润;L-NAT可使之减轻.(2)免疫组织化学染色显示,与Sham组相比,IR组激活型Caspase-3、Bcl-2和bax的表达升高,L-NAT干预后,Caspase-3和Bax的表达下降,而Bcl-2的表达进一步升高.结论 L-NAT可抑制肝脏缺血再灌注损伤引起的小肠上皮细胞凋亡,减轻小肠上皮细胞损伤.     

Beclin1、LC3和mTOR在肝癌中的表达及临床意义

目的 通过检测Beclin1、LC3和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在肝癌组织中的表达,并结合各相关临床病理指标,从而探讨Beclin1、LC3和mTOR的表达水平在肝癌发生发展中的作用及其相互之间的关系.方法 采用免疫组织化学技术,检测56例肝癌组织和40例正常肝脏组织中Beclin1、LC3和mTOR蛋白的表达情况,并分析二者与肝癌各相关临床病理特征之间的关系.结果 Beclin1、LC3和mTOR蛋白在肝癌组织中的阳性表达率分别为75％、70％和50％,均明显高于正常肝组织中的阳性表达率25％、30％、28％,差异有统计学意义(P<0.05).Beclin1与LC3在肝癌中表达呈正相关(r=0.643,P<0.01),与mTOR表达之间无明显相关性(r=-0.167,P>0.05).LC3与mTOR表达呈负相关(r=-0.386,P<0.01).Beclin1、LC3和mTOR的表达均与年龄、性别、肿瘤大小、HBSAg、AFP值等均无显著相关性(P>0.05),但与病理学分级和有无胆管癌栓有关(P<0.05).结论 Beclin1、LC3和mTOR的异常高表达可能与肝癌的发生关系密切.     

人胚胎肝干细胞的形态特点

目的:观察胚胎发育早期肝干细胞的形态特征、时空分布及分化,以探讨肝干细胞的生物学特征．方法:运用发育第3-12 wk人胚标本47例(其中 3．5 wk各8例;6-8 wk各5例,9-12 wk各2例),石蜡切片,连续切片,免疫组化染色,光镜下观察人胚肝及肝干细胞的发育及其AFP、c-Met和 CK19的时空表达．结果:发育第3 wk,肝芽形成,第4 wk形成肝索,第5 wk出现原始肝血窦．第3-5 wk人胚肝芽和肝索细胞排列紧密,较小,形态不规则,核圆形或卵圆形,核质比例大,核深染,胞质颜色较淡,偏蓝色,显示出幼稚细胞的形态学特征,并呈甲胎蛋白(α-Fetoprotein,AFP)、c-Met 阳性反应．第6 wk,肝索内出现了体积大、核大、淡染的细胞,呈AFP、c-Met阴性反应．随胚龄增加,这类细胞数量增加．10-12 wk． AFP、c-Met阳性细胞主要分布于汇管区周围． CK19阳性反应在7 wk时开始出现于一些与 AFP、c-Met阳性反应的细胞形态类似的肝索细胞中．10-11 wk时,CK19阳性反应主要位于汇管区附近的肝索细胞、胆管板细胞及胆管上皮细胞,12 wk时,CK19阳性信号仅见于胆管板和胆管上皮细胞．此时所有的胆管板细胞及胆管上皮细胞均呈AFP、c-Met和CK19阳性．结论:人胚发育3-5 wk肝实质由肝干细胞组成,其表型为AFP /c-Met ．6 wk,肝干细胞开始向肝细胞系分化,7 wk向胆管系分化,10-12 wk,肝干细胞主要局限于汇管区周围的肝索, 与成年肝中卵圆细胞(成年肝干细胞)的分布一致．AFP ／c-Met／ CK19 细胞可能为胆管祖细胞．     

NEP1-40对SD大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨NEP/Nogo-66 1-40peptides(NEP1-40)对视网膜缺血再灌注损伤的保护作用。方法SD大鼠分成正常对照组,视网膜缺血再灌注组和NEP1-40组。采用单眼生理盐水前房加压60min再灌注24h制作视网膜缺血再灌注损伤模型,石蜡切片,HE染色,光学显微镜下观察视网膜细胞形态结构的变化,免疫组化观察各组视网膜中DNA修复酶Ku70的表达变化,PCR检测各组视网膜中Ku70 mRNA表达变化。结果缺血再灌注损伤组(IR组)视网膜结构紊乱,细胞肿胀变性,Ku70蛋白及mRNA表达较正常组下降(<0.01),NEP1-40组视网膜结构明显改善,Ku70蛋白及mRNA表达较IR组升高(<0.01)。结论 NEP1-40对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用可能与增加Ku70蛋白及mRNA的表达相关。     

第3～5周人胚肝的细胞特征和生长因子及其受体表达

背景:早期肝的发育与横隔间充质和原始心脏的发育在时间和空间上存在密切关系,来自原始心脏和横隔间充质的信号分子可诱导前肠内胚层细胞向肝细胞的特化,横隔间充质为肝芽的形成提供了一个适宜的环境,并可促进其生长和分化。但这一诱导过程的分子机制尚不清楚。目的:利用发育第3～5周人胚标本,选择甲胎蛋白、细胞角蛋白19、c-Met作为肝干细胞的标记物,观察早期人胚胎的发育及肝干细胞的形态特征,以明确肝干细胞的特征和影响其增殖、分化的因素,为肝干细胞的基础研究和临床应用提供实验依据。设计:开放性实验。单位:潍坊医学院人体解剖学教研室。材料:实验于2004-09/2005-01在成都医学院科研中心完成。选择2个月内流产的新鲜人胚胎标本20例,20min内用40g/L多聚甲醛固定,常规石蜡包埋、连续切片,苏木精-伊红染色,显微镜下观察,参照Jirasek的人胚发育分期标准,根据胚胎的长度、体节的数目及器官发育状况确定胚龄。方法:选择胚龄第3～5周的标本,SABC法进行免疫组织化学染色。多克隆抗肝细胞生长因子、c-Met、胰岛素样生长因子I及其受体、转化生长因子β1、转化生长因子β受体1、转化生长因子β受体2抗体,单克隆抗增殖细胞核抗原、甲胎蛋白和细胞角蛋白19抗体,4℃孵育过夜,羊抗兔或羊抗鼠IgG及SABC液室温下分别孵育2h,二氨基联苯胺显色。以磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。光学显微镜下观察、拍照。主要观察指标:第3～5周人胚肝干细胞的形态特征及标记物的免疫组织化学染色,肝细胞生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子I及其受体在第3～5周人胚肝、原始心脏及横隔间充质细胞中的表达。结果:①第3～5周人胚肝干细胞的形态特征及标记物的免疫组织化学染色观察:第3周末肝芽形成,第4周肝芽的细胞伸入横隔间充质内形成肝索,构成肝索的细胞具有与第3周末相同的形态特点。第5周时这些细胞数量明显增加,细胞体积有所增大,胞核嗜碱性稍减弱,胞质的嗜酸性增强,但细胞的形态仍均匀一致。第3～4周时肝索的细胞呈增殖细胞核抗原的反应阴性,5周时开始出现阳性反应,主要分布在细胞核,少数细胞的胞质为弱阳性。第3～5周时多数肝索细胞都为甲胎蛋白和c-Met阳性,甲胎蛋白阳性细胞的免疫反应沉淀物在胞核、胞质及细胞膜中均存在;c-Met阳性反应主要分布于细胞核,胞质亦可见较弱的阳性反应。而这些细胞为细胞角蛋白19阴性。②肝细胞生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子I及其受体在第3～5周人胚肝、原始心脏及横隔间充质细胞中的表达:发育第4周组成肝索的细胞表达c-Met,而不表达其他的因子或受体。第5周时,除了肝细胞生长因子以外的其他因子均在肝索细胞表达。转化生长因子β1及其受体转化生长因子β受体1、转化生长因子β受体2的免疫反应沉淀物主要存在于细胞质和细胞膜,胰岛素样生长因子I及其受体的阳性反应在细胞核、细胞质以及细细胞膜均可见。第3～5周时,肝芽或肝索周围的心肌细胞和间充质细胞呈肝细胞生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子I免疫反应阳性,阳性信号主要聚集在细胞质,少数胞核亦有阳性。结论:①人胚胎发育的第3周末,前肠腹侧的部分内胚层细胞特化为肝干细胞。②发育第3～5周人胚肝的细胞为未分化的肝干细胞,若拟研究人胚肝干细胞,此时取材、并利用肝干细胞特异性的标记物,可得到具有双向分化潜能的肝干细胞。对于鼠胚肝干细胞的研究,也可利用人、鼠胚龄的对应关系,推算出其肝干细胞存在的时间、从而决定取材的时间点。③肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子I、转化生长因子β1等生长因子促进早期人胚肝的发育。     

三种因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景:间充质干细胞的生物学特性及影响分化调控因子的研究认为,体外原代培养的间充质干细胞自然分化为肝细胞的比例较低,选择一种合适的诱导剂提高其分化为肝细胞的比例尤为必要.目的:以肝细胞生长因子、表皮生长因子及成纤维生长因子体外联合,验证其诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-08在潍坊医学院实验中心完成.材料:Sprague-Dawley大鼠40只,由潍坊医学院实验动物中心提供.方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代细胞,设立2组:空白对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基;联合诱导组在此基础上,另加入10 μg/L成纤维生长因子、8 pg/L.肝细胞生长因子、8 μg/L表皮生长因子.主要观察指标:倒置显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫荧光染色观察甲胎蛋白及白蛋白的表达,PAS检测糖原的表达,靛青绿摄入情况,酶学检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的水平.结果:联合诱导组细胞呈多角形、卵圆形或圆形细胞的特征性改变,空白对照组骨髓间充质干细胞仍保持梭形或纺锤形.联合诱导组培养14 d可见白蛋白和甲胎蛋白免疫反应阳性细胞:诱导7 d时偶见PAS阳性细胞与靛青绿阳性细胞,随诱导时间延长,阳性细胞逐渐增多;诱导14 d时开始检测到谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的合成,21 d达高峰,之后下降.上述各指标空白对照组细胞均呈阴性.结论:成纤维生长因子、肝细胞生长因子与表皮生长因子体外联合应用,能够成功诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化.     

HepG2细胞在不同琼脂糖浓度下克隆形成能力的比较

目的: 探讨分离细胞克隆的最佳细胞密度和最适琼脂浓度, 为肿瘤干细胞的筛选提供更广阔的思路.方法: 将HepG2单细胞悬液与10 g/L的琼脂糖相混合, 在2 g/L(A组)和3 g/L(B组)琼脂中接种不同密度的HepG2细胞, 14 d后观察克隆形成.结果: 100-1000个/孔的各个实验组中, A组细胞的克隆数高于B组, 差异有统计学意义( t =4.36, P<0.05);在细胞密度为100-500个/孔时,A、B组细胞克隆形成率随着细胞密度的增加逐渐增加;600-1000个/孔, A、B组均随着细胞密度的逐渐加大, 克隆形成率呈现下降趋势.结论: 在进行软琼脂克隆形成实验时, 可以采用2 g/L的上层琼脂浓度, 并采用10 g/L的琼脂糖凝胶作为储备胶, HepG2细胞在500个/孔时的克隆形成率最高.     

胎肝滤液诱导大鼠胎盘间充质干细胞向肝细胞的分化

目的 探讨PDMSCs向肝细胞增殖和分化的体外培养条件及方法.方法 孕20 d的大鼠无菌条件下取胎盘,经胶原酶消化、密度离心、贴壁筛选法分离培养胎盘源间充质干细胞,并对其表面抗原进行鉴定.在体外培养体系中加入胎肝滤液,模拟体内肝脏微环境,诱导PDMSCs向肝细胞定向分化,以免疫细胞化学检测干细胞标志物；PAS检测糖原表达.结果 在体外培养条件下,PDMSCs贴壁生长为成纤维样细胞,CD44表面标志物检测阳性；PDMSCs经胎肝滤液诱导14d时细胞呈现圆形、卵圆形的特征性改变,AFP、CK19表达阳性.结论 胎肝滤液能够诱导PDMSCs定向分化为肝细胞样细胞.