多平面重建联合容积再现重建对肺小结节早期诊断的价值研究

目的 探索多平面重建（MPR）联合容积再现重建（VR）对肺小结节（直径≤1.0cm）的早期诊断价值。方法 回顾性分析159例患者经手术病理确诊肺小结节的术前CT薄层扫描（TSCT）、MPR和VR图像表现,采用ROC曲线比较分析MPR联合VR与TSCT诊断肺小结节的灵敏度、特异度和正确率,并对阅片医师与病理金标准的一致性及阅片医师之间的一致性进行分析评价。结果在毛刺征、分叶征、血管集束征以及胸膜牵拉征的显示上,MPR联合VR均优于TSCT,差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）。3位阅片医师（A、B、C）采用MPR联合VR诊断的灵敏度和正确率均明显优于采用TSCT,差异均有统计学意义（均P＜0.05）,而特异度差异均无统计学意义（均P＞0.05）;MPR联合VR诊断结果与病理金标准的一致性（A：κ=0.773,B：κ=0.754,C：κ=0.783）以及阅片医师之间的一致性（A和B：κ=0.743,B和C：κ=0.789,A和C：κ=0.751）均优于TSCT。结论MPR联合VR能显著提高对直径≤1.0cm肺小结节早期诊断效能。     

引起儿童呼吸道感染的优势肠道病毒及其血清型和流行特征分析

目的 了解近年杭州地区引起儿童呼吸道感染的优势肠道病毒(EVs)及其血清型以及流行特征和易感人群。方法 收集2016-2018年本地区2 164例发热伴呼吸道感染症状患儿咽拭标本,采用EVs通用引物的实时荧光定量RT-PCR检测EVs核酸,阳性标本采用EVs VP1/VP2基因通用引物的套式PCR扩增后测序分型。分析患儿性别、年龄、感染的优势EVs及其血清型等流行病学特征。结果 2 164 例患儿咽拭子标本中有508 例(23.5%)EVs核酸阳性,其中290 例成功测序分型。检出的EVs中,柯萨奇病毒A 组(CoxA)和B 组(CoxB)分别占75.2%和11.7%、EV71占8.9%、埃可病毒(Echo)占4.1%,CoxA检出率高于CoxB、EV71和埃可病毒(P<0.05)。在检出的CoxA中,CoxA6(39.5%)和CoxA10(33.0%)检出率高于CoxA16、CoxA4和CoxA2(P<0.05)。1~3 岁男性儿童是EVs易感人群(P<0.05),其中男性儿童易感CoxA6、女性儿童易感CoxA10(P<0.05)。结论 EVs是本地区儿童呼吸道感染的重要病原体,柯萨奇病毒及其CoxA6和CoxA10分别是优势EVs和血清型,1~3 岁儿童是本地区EVs主要易感人群,男性比女性更易感。     

白细胞介素 １７和转化生长因子 β２ 在哮喘中的表达及意义

摘要：目的　探讨哮喘患者外周静脉血白细胞介素 １７ （ＩＬ １７） 和转化生长因子 β２ （ＴＧＦ β２） 的表达及其 意义。方法　收集２０１４年２月至２０１６年５月中国人民解放军第一一七医院呼吸内科７２例哮喘急性发作患 者为哮喘组,１８例健康者为对照组。采用ＥＬＩＳＡ 法分别进行ＩＬ １７、ＴＧＦ β２检测,哮喘患者进行规范化 梯度治疗３个月后复测ＩＬ １７、ＴＧＦ β２、肺功能。结果　随着哮喘严重程度的增加,患者ＩＬ １７、ＴＧＦ β２ 浓度逐渐增加,第１秒用力呼气容积占预计值百分比（ＦＥＶ１％ｐｒｅｄ）逐渐下降,差异有统计学意义（犉＝ ３７．７９４、２７．５５７、４４．９９３,犘＜０．０１）。各组间ＩＬ １７、ＴＧＦ β２ 差异有统计学意义（犘＜０．０１）。ＩＬ １７、 ＴＧＦ β２水平与患者年龄、体质量指数（ＢＭＩ） 无相关性（犘＞０．０５）, 与ＦＥＶ１％ｐｒｅｄ 呈负相关（狉＝ －０．７９４、－０．４６８,犘＜０．０１）。ＩＬ １７与ＴＧＦ β２水平呈正相关（狉＝０．５２７,犘＜０．０１）。治疗３个月后,７２ 例哮喘患者ＩＬ １７、ＴＧＦ β２ 较治疗前降低,ＦＥＶ１％ｐｒｅｄ 升高,差异有统计学意义（狋＝１１．６１９、９．３７１、 １２．９４８,犘＜０．０１）;ＩＬ １７、ＴＧＦ β２水平仍高于对照组,ＦＥＶ１％ｐｒｅｄ低于对照组,差异有统计学意义（狋＝ １１．００７、１４．５０１、８．３９６,犘＜０．０１）。结论　哮喘患者ＴＧＦ β２、ＩＬ １７ 表达水平与哮喘发病呈正相关。 ＴＧＦ β２、ＩＬ １７的测定对哮喘严重程度、炎症水平及气道重建程度的评估有参考价值。 关键词：白细胞介素 １７;转化生长因子 β２;哮喘;急性发作期;相关性分析 中图分类号：Ｒ５６２．２５　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９ ６６３９ （２０１８）０４ ０３０２ ０４     

联合应用胰岛素样生长因子-Ⅰ和骨形成蛋白-2促小鼠成骨样细胞及成纤维细胞增殖和分化的效应

目的探讨重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ(rhGF-Ⅰ)和重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)单独及联合应用对MC 3T3-E1和NIH 3T3细胞增殖和分化的影响.方法单独或联合应用不同浓度rhIGF-Ⅰ和rhBMP-2作用于MC 3T3-E1和NIH 3T3细胞后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞分化情况,放射免疫法检测细胞分泌的骨钙素(OC)水平.结果 1～75 ng/ml rhIGF-Ⅰ与10～100ng/ml rhBMP-2作用于MC 3T3-E1和NIH 3T3细胞后,均能显示明显的促细胞增殖(P＜0.01)及使ALP活性增高(P＜0.05)的作用.各浓度rhIGF-Ⅰ或rhBMP-2对MC 3T3-E1及NIH3T3细胞作用8、24和48h的MTT检测结果相似.rhIGF-Ⅰ和rhBMP-2联合作用后,对两种细胞的促增殖、增强ALP活性的作用均较各自单独作用更为明显(P＜0.05).单独或联合应用不同浓度rhIGF-Ⅰ和rhBMP-2对细胞分泌的OC水平均无显著影响(P＞0.05).结论 rhIGF-Ⅰ和rhBMP-2具有明显的促细胞增殖及早期分化的协同作用,但对成骨末期细胞分化影响不大,其活性主要与使用剂量有关.     

刚地弓形虫入侵细胞过程中细胞骨架和Ca2+ 浓度变化

目的 探讨弓形虫入侵不同类型细胞过程中胞内游离Ca²⁺ 浓度及细胞骨架的变化。 方法 常规方法制备刚地弓形虫RH株速殖子悬液，分别感染吞噬性细胞（小鼠单核巨噬样细胞J774A.1）和非吞噬性细胞（人脐静脉内皮细胞HUVEC）。光学显微镜观察弓形虫感染情况及细胞骨架抑制剂秋水仙素、松胞菌素D对感染率的影响。用荧光显微镜观察弓形虫速殖子入侵J774A.1、HUVEC过程中细胞微丝和微管变化。用激光共聚焦显微镜检测弓形虫速殖子入侵过程中宿主细胞游离Ca²⁺ 浓度变化。 结果 正常J774A.1胞内游离Ca²⁺ 浓度为102.0%±6.2%。弓形虫感染后 2 min游离Ca²⁺ 浓度升高，测得荧光强度为 305.2%±21.5%，感染后30～40 min最高荧光强度为1219.7%±58.4%，显著高于基础值（P<0.01）。而经磷脂酶C抑制剂U73122预处理的J774A.1，Ca²⁺ 浓度无明显变化(P>0.05）；虫体入侵过程中J774A.1微丝结构发生凝集。微丝结构抑制剂松胞菌素D（P<0.01）和微管结构抑制剂秋水仙素（P<0.05）均可明显降低弓形虫感染率。弓形虫入侵HUVEC过程中Ca²⁺ 浓度变化不明显（P>0.05），宿主细胞微丝、微管结构亦无明显变化。松胞菌素D和秋水仙素对弓形虫入侵HUVEC的能力影响均较小(P>0.05）。 结论 弓形虫入侵吞噬性细胞J774A.1过程中胞内游离Ca²⁺ 浓度显著升高，细胞骨架微丝结构发生凝聚，而入侵非吞噬性细胞HUVEC过程中胞内游离Ca²⁺ 浓度和细胞骨架均无明显变化。     

创伤弧菌溶细胞毒素单克隆抗体制备及其鉴定

目的制备创伤弧菌(Vibrio vulnificus)溶细胞素vvhA基因产物鼠源性单克隆抗体并鉴定其特异性和免疫性,为进一步研制创伤弧菌检测试剂盒奠定基础。方法采用IPTG诱导目的重组蛋白rvvhA表达,Ni-NTA亲和层析法提纯rvvhA,SDS-PAGE检测表达和提纯效果。采用杂交瘤技术和rvvhA-ELISA制备并筛选分泌rvvhA单克隆抗体的细胞株,有限稀释法进行细胞克隆。采用免疫双扩散法鉴定单克隆抗体类型。采用ELISA、免疫双扩散法和Western Blot鉴定单克隆抗体的效价和特异性。结果在0.5mmol/L IPTG诱导下,rvvhA产量可占细菌总蛋白的18%。提纯的rvvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带。共获得9株rvvhA抗体阳性的杂交瘤细胞株,其中A5E8和C3B6株可持续分泌高效价特异性单克隆抗体,其抗体类型分别为IgG1和IgG2a。A5E8和C3B6单克隆抗体有较高特异性,与多种其它细菌蛋白不发生免疫反应,对rvvhA及创伤弧菌GTC333株和WZ01株蛋白的ELISA检测阳性的效价可达1∶4000~1∶8000、免疫双扩散效价为1∶4~1∶8,Western Blot结果显示此等单克隆抗体均能有效识别rvvhA。结论本研究成功地获得了2株稳定分泌rvvhA特异性单克隆抗体的鼠源性杂交瘤细胞株,rvvhA单克隆抗体可用于检测自然表达的创伤弧菌溶细胞素。     

幽门螺杆菌黏附素A有效T和B联合抗原表位噬菌体展示和抗原性测定

目的 分析并确定幽门螺杆菌黏附素A(HpaA)分子中有效T细胞和B细胞联合(T/B)抗原表位.方法 重组表达HpaA(rHpaA)并免疫家兔制备抗血清.采用生物信息学技术预测和分析HpaA分子中T细胞和B细胞表位,PCB扩增T/B联合表位肽片段并构建其噬菌体展示系统.采用PEG/NaCl沉淀法提纯展示了T/B联合表位的重组噬菌体PⅢ蛋白(rPⅢ).分别以商品化幽门螺杆菌全菌IgG抗体和rHpaA抗血清为一抗,采用Western blot和ELISA对rPⅢ蛋白中展示的T/B联合表位进行筛选和鉴定.采用MTT检测rHpaA免疫小鼠脾细胞在不同重组噬菌体蛋白刺激下的增殖情况.结果 HpaA分子中共有5个T/B联合表位:HpaA10、HpaA37、HpaA79、HpaA116和HpaA143.所有T/B联合表位均成功地展示于M13噬菌体PⅢ蛋白表面.Western blot、ELISA和淋巴细胞增殖试验结果 均显示,HpaA116是优势抗原表位,HpaA37和HpaA79为有效抗原表位,HpaA10和HpaA143为无效抗原表位.结论 本研究成功地构建了幽门螺杆菌HpaA的T/B联合表位肽噬菌体展示系统.HpaA37和HpaA79,尤其是HpaA116是HpaA有效T/B联合抗原表位.     

五虎汤对婴幼儿哮喘患儿外周血树突状细胞表面共刺激分子表达的影响

目的 观察五虎汤对婴幼儿哮喘患儿外周血树突状细胞（DC）共刺激分子CD80、 CD83和CD86表达的影响,为探讨五虎汤防治本病的机制提供依据。     

细菌药物钝化酶基因分布及其表达诱导与抑制机制的研究

目的：了解临床常见病原菌药物钝化酶基因及其优势基因携带模式,抗生素诱导药物钝化酶基因表达上调的作 用及其与细菌组氨酸激酶的关系。 方法：采用PCR和测序法,了解金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌临床菌株携带的β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类钝化酶基因。采用实时荧光定量RT-PCR,了解抗生素诱导及组氨酸激酶阻断剂氯氰碘柳胺抑制药物钝化酶基因表达的作用。 结果：63株大肠埃希菌中检出4种β-内酰胺类、2种氨基糖苷类和1种大环内酯类钝化酶基因,优势基因携带模式为[TEM＋CTX-M]＋aac(3)-Ⅱ＋mphA 16株（25.4%）和[TEM＋CTX-M]＋aac(6′)-Ⅰb 13株（20.6%）。24株金黄色葡 萄球菌中检出2种β-内酰胺类、3种氨基糖苷类钝化酶基因,优势基因携带模式为aph(3′)（41.7%）或aac(6)-Ⅰe- aph(2)-Ⅰa（25.0%）。28株肺炎克雷伯菌中检出4种β-内酰胺酶、2种氨基糖苷类钝化酶基因,优势基因携带模式为 [TEM＋SHV]＋[aac(6′)-Ⅰb＋aac(3)-Ⅱ]（28.6%）和[TEM＋SHV]＋[aac(6′)-Ⅰb＋aac(3)-Ⅱ]＋mph（17.8%）。鲍曼不动杆菌和阴沟肠杆菌也以携带两类或三类药物钝化酶基因为优势模式。1/4 MIC青霉素、头胞噻肟和链霉素,能诱导3种β-内酰胺类和4种氨基糖苷类钝化酶基因表达显著上调（P<0.05）,该诱导作用可被氯氰碘柳胺 所抑制（P<0.05）。 结论：上述临床常见病原菌多携带多类药物钝化酶基因并存在不同的优势基因携带模式。低浓度抗生素可能诱导药物钝化酶基因表达上调,但可被组氨酸激酶阻断剂所抑制。     

汉坦病毒N蛋白的重组表达及其用于IgM直接捕捉ELISA的建立和应用

目的克隆并表达汉坦病毒（HV）Z10株（HV—Z10）N蛋白（NP）编码基因，建立基于辣根过氧化酶（HRP）标记重组NP（rNP）的rNP—IgM直接捕捉ELISA，检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清并评价其检测效果。方法PCR扩增HV—Z10株NP编码基因，基因工程方法构建NP编码基因原核表达系统pET28a—Z10N—E．coli BL21DE3。SDS-PAGE了解rNP表达情况，离子交换法和Ni—NTA亲和层析法提纯rNP。Western blot检测rNP的特异性免疫反应性。建立HRP标记rNP—IgM直接捕捉ELISA检测HFRS患者血清样品，并与常规HV—IgM间接捕捉ELISA进行比较。结果pET28a—Z10N—E．coli BL21DE3高效表达rNP。提纯rNPSDS-PAGE显示单一蛋白条带，HV-IgG能有效识别rNP并与之结合。94．73％（90／95）HFRS患者血清样品rNP—IgM直接捕捉ELISA检测结果阳性，HV—IgM间接捕捉ELISA阳性率为92．63％（88／95）。两种IgM捕捉ELISAs检测的HFRS患者血清样品A450值分布及对多份不同稀释度血清检测的A450，均值变化均相似。结论成功构建了HV—Z10株NP编码基因高效原核表达系统。所建立的rNP—IgM直接捕捉ELISA可作为HFRS简便、安全、敏感、特异的血清学诊断新方法。