低氧诱导因子1α诱导卵巢癌细胞周期阻滞的研究

目的：探讨低氧诱导因子1α（HIF-1α）对卵巢癌细胞周期的阻滞作用。方法: 采用化学性低氧诱导剂氯化钴（CoCl2）和物理性低氧培养箱两种方法对体外培养的卵巢癌SW626细胞诱导低氧，用诱骗法（decoy）阻断HIF-1α功能，Western blotting、RT-PCR和流式细胞术分别检测HIF-1α蛋白、mRNA的表达水平和细胞周期比率。结果： B1组(3.75±1.31)和C1组(3.48±1.01) HIF-1α蛋白表达水平明显高于A1组(0.97±0.31)（P<0.05), decoy法对HIF-1α蛋白表达没有明显影响(P>0.05)；A1组（0.65±0.32）和B1组（0.64±0.34）HIF-1α mRNA表达水平明显低于C1组（1.28±0.62）（P<0.05），decoy法对HIF-1α mRNA 表达没有明显影响（P>0.05）；流式细胞术检测发现B1组（81.78±24.33）和C1组（77.62±22.76）G0/G1期细胞比率显著高于A1组（49.49±18.54）（P<0.05）；B2组（61.54±20.84）明显低于B1组（P<0.05），C2组明显低于C1组（56.03±21.42），而A1组和A2组之间无明显差异（P>0.05）。结论：CoCl2或物理性低氧均能明显诱导卵巢癌细胞SW626 G0/G1期细胞周期阻滞和HIF-1α的表达，HIF-1α在低氧引起的卵巢癌细胞SW626的细胞周期阻滞中起重要作用。     

癌基因c-myc和n-ras在妊娠滋养细胞疾病中表达的研究

为研究癌基因c-myc和n-ras在妊娠滋养细胞疾病(GTD)发生、发展中的作用,用地高辛标记的c-myc、n-ras裸核探针与54例石蜡包埋的GTD组织进行原位杂交.结果显示c-myc mRNA在葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌组织中阳性表达率分别为44.4%、55.6%和83.3%,绒癌c-myc阳性表达率高于葡萄胎(P＜0.05).n-ras mRNA在葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌组织中阳性表达率分别为88.9%、77.8%和44.4%,绒癌n-ras阳性表达率显著低于葡萄胎(P＜0.01)和侵蚀性葡萄胎(P＜0.05).Ⅲ～Ⅳ期妊娠滋养细胞瘤(GTT)组织中c-myc阳性表达率为90.9%,高于I期的45.5%(P＜0.05).c-myc和n-ras基因在GTT组织中共同表达率为47.2%.结果提示c-myc基因与GTD病变的发展及GTT临床分期有关,n-ras基因可能为GTT发生的早期事件,c-myc和n-ras基因在GTD癌变过程中起协同作用.     

层粘连蛋白及其受体在卵巢癌组织中的表达及其临床意义

肿瘤转移扩散是卵巢癌患者死亡最常见的原因。层粘连蛋白(LN)作为细胞外基质和基底膜的重要组织成分，与肿瘤细胞表面的层粘连蛋白受体(LNR)结合，在肿瘤浸润、转移中发挥重要作用。本研究采用免疫组织化学(组化)EnVision二步法检测了正常卵巢、良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中LN及其相对分子质量为67000的受体(67LNR)的表达，探讨其与卵巢癌病理分化程度、临床分期、腹水形成和转移的关系。     

反义LRP寡核苷酸对卵巢癌多药耐药细胞系OVCAR-3顺铂耐药性的影响

目的:探讨针对肺耐药基因(LRP gene)设计的反义寡核苷酸(AsODN)对人卵巢癌多药耐药细胞系OVCAR-3顺铂(DDP)耐药性的逆转作用.方法:采用罗丹明B(SRB)显色法检测LRP AsODN和DDP细胞毒性作用;采用脂质体(1iplfectamine 2000)介导LRP AsODN转染人卵巢癌多药耐药细胞系OVCAR-3;采用逆转录酶链式反应(RT-PCR)和Westem blot法检测LRP AsODN转染前后OVCAR-3细胞中LRP的表达:采用流式细胞仪测定OVCAR-3细胞在顺铂作用后的凋亡率.结果:LRP AsODN浓度低于800nmol/L时,对OVCAR-3细胞无明显细胞毒作用;LRP AsODN能明显减少OVCAR-3细胞中LRP mRNA和蛋白的表达,增加其顺铂敏感性,且与剂量呈正相关;转染LRP AsODN前后的OVCAR-3细胞在DDP作用后,凋亡率分别为(15.43±1.14)%和(27.43±2.05)%,两者间差异有显著性意义(p=0.001).结论:LRP AsODN能有效阻断OVCAR-3细胞内LRP的表达,恢复细胞对DDP的敏感性.     

HDAC抑制剂丁酸钠抑制芳香酶肿瘤相关性启动子活性的研究

目的：探索芳香酶基因乳腺癌相关启动子特异性阻滞剂定点抑制肿瘤局部组织原位雌激素合成的可能性。方法：从乳腺癌标本中获取原代脂肪成纤维细胞进行培养，加入乳腺癌细胞MCF-7的条件培养液，作为芳香酶肿瘤相关性启动子(PI1，PI3)激活的研究细胞模型。用启动子特异性逆转录PCR、芳香酶活性检测等方法观察抗组蛋白乙酰化酶(HDAC)抑制剂丁酸钠(NaBu)对PI1，PI3活性的影响。结果：NaBu特异性抑制PI1，PI3基础和诱导水平转录本，但对另一种芳香酶启动子P14的表达无明显影响。其机制在于抑制PI1，PI的转录。结论：NaBu在乳腺癌治疗中具有潜在的临床价值，进一步研究丁酸钠的分子效应靶点，将为了解乳腺癌发病的关键环节提供良好的切入点。     

短发夹状RNA抑制AKT2基因表达增强卵巢上皮性癌细胞对紫杉醇敏感性的研究

RNA干扰（RNAi）技术是运用双链RNA引发的转录后水平基因沉默机制,特异性抑制靶基因转录,进而下调相应蛋白表达水平及功能.新近的RNAi技术,是利用DNA载体直接在体内表达短发夹状RNA（shRNA）,特异性封闭相应的靶基因mRNA,抑制mRNA的翻译.与早期的RNA干扰技术相比,该方法的特异性和干扰效率均有较大提高,已广泛应用于多种研究领域.利用RANi技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达,使这些基因保持在沉默或休眠状态,从而使肿瘤细胞增殖速度减慢,凋亡加快,显示了RNAi技术用于肿瘤基因治疗的可行性和有效性.     

宫颈癌FHIT蛋白表达及与临床的相关性

目的:探讨候选抑癌基因FHIT产物FHIT蛋白在由正常宫颈上皮过渡至子宫颈癌过程中的表达缺失情况及其临床意义.方法:应用SP免疫组化染色法检测65例子宫颈癌,25例宫颈上皮肉瘤样病变(CIN),14例慢性子宫颈炎,5例正常子宫颈组织中FHIT蛋白的表达情况,并与组织学类型、组织学分级、肌层浸润深度和临床分期等生物学行为进行相关分析.结果:FHIT蛋白在子宫颈癌前病变和宫颈癌组织中的表达明显减少,缺失率分别为56.00%和72.31%,表达缺失率与组织学类型和组织学分级有关(P＜0.05),与子宫颈癌的肌层浸润深度和临床分期无关(P＞0.05).结论:FHIT表达缺失是子宫颈癌发生的早期分子事件,FHIT蛋白表达缺失是早期诊断子宫颈癌及癌前病变较好的生物学标志.     

PP2药物抑制乳腺癌细胞侵袭与增殖的机制

目的以PP2E4-Amino-5-（4-Chloro-Phenyl）-7-（t-Butyl）PyrazoloE3,4-d]Pyrimidine]药物（src激酶抑制剂）处理乳腺癌细胞,检测src激酶及E-cadherin蛋白表达水平的变化,观察PP2对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响,并探讨其可能的机制。方法PP2处理乳腺癌细胞MDA-MB231,Westernblot检测src及其相关蛋白的表达;Boyden小室实验检测细胞侵袭能力;MTT检测细胞的增殖能力。结果PP2处理MDA-MD231细胞后,src表达水平明显降低,Ecadherin表达水平升高;细胞的增殖和侵袭能力均受到明显抑制,剂量越高抑制作用越明显（P〈0．05）。结论PP2通过提高细胞粘附分子E-cadherin的表达,从而抑制乳腺癌细胞MDAMB-231的增殖和侵袭能力。     

smad4 shRNA 真核表达质粒的构建及鉴定

 目的 针对smad4基因的不同部位,构建不同smad4shRNA表达质粒载体,在转录后水平抑制smad4的表达,对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆。方法 用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中,构建smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa,经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。结果 3个smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确。RT-PCR、Westernblotting均证实：3种shRNA重组质粒中pGenesil-smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4mRNA丰度及smad4蛋白表达。结论 成功构建了smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3,并筛选出特异而高效地阻断smad4表达的克隆。此实验结果为进一步研究smad4蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂Apicidine对宫颈癌HeLa细胞的抑制作用及机制研究

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂Apicidine对宫颈癌细胞的杀伤作用和机制。方法:用不同浓度的Apicidine作用于体外培养的宫颈癌细胞株HeLa和正常呼吸道上皮细胞REC;用MTT法检测细胞生长存活率;用流式细胞术(FCM)定量检测细胞凋亡及细胞周期的变化;用RT-PCR法和Western blot法分析Apicidine作用后宫颈癌细胞中p21WAF1和p53表达的变化。结果:Apicidine纳摩尔级浓度即能有效地抑制宫颈癌细胞增殖,对正常细胞无明显抑制效应。FCM结果表明,Apicidine能显著诱导宫颈癌细胞发生凋亡,对正常细胞无明显促凋亡作用;加入2μmol/L Apicidine作用24h和48h后宫颈癌细胞HeLa凋亡率分别为(10.11±0.63)%和(23.28±0.34)%,差异有显著性(P<0.05),正常呼吸道上皮细胞REC凋亡率分别为(5.81±0.92)%和(6.8±0.55)%,差异无显著性(P>0.05);FCM结果亦表明,Apicidine主要引起G0/G1期细胞周期阻滞,1μmol/L Apicidine处理24h后HeLa细胞G0/G1期细胞显著增多,由(46.8±3.2)%增至(69.5±6.1)%,差异有统计学意义(P<0.05);RT-PCR和Western blot结果显示,Apici-dine能显著诱导p21WAF1RNA和蛋白水平表达,对p53表达无明显影响。上述结果都呈现明显的量-效与时-效关系。结论:Apicidine在体外能有效地抑制人宫颈癌细胞生长,对人正常细胞无明显影响,其抗肿瘤生长机制之一可能是通过上调p21WAF1蛋白水平和引起G0/G1期细胞周期阻滞实现的。