重组MHCⅠ类分子K^b-EGFP分子的构建及表达

目的 构建绿色荧光蛋白标记的MHCⅠ类分子K^b(K^b-EGFP融合蛋白)，并在哺乳动物细胞中获得功能性表达。方法 RT-PCR的方法获得小鼠MHCⅠ类分子K^b cDNA，克隆入真核表达载体pEGFP-N1中EGFP分子的上游，脂质体转染COS-7细胞，G418加压筛选获得抗性重组细胞。荧光显微镜下观测重组分子的表达及胞内定位情况。结果 分子克隆的方法获得了预期的重组质粒，质粒经DNA序列测定证实阅读框无误，转染COS-7细胞后的抗性克隆胞浆内可以观察到明亮的绿色荧光，特征性地分布于细胞质膜，及核周、膜下的囊泡结构中。结论 所构建的K^b-EGFP融合蛋白在细胞内表达后具有MHCⅠ类分子的特征性分布，提示该重组分子具有野生型MHCⅠ类分子的生物学特性和胞内分布特征，为进一步深入研究MHCⅠ类分子胞内动态分布及分子功能提供了良好的细胞和分子模型。     

Angiotensin-(1-7)对血管平滑肌细胞钙化的影响及信号转导通路

目的:在钙化大鼠主动脉血管平滑肌细胞上观察血管紧张素-(1-7)[Angiotensin-(1-7)]对钙化的影响及其信号通道。方法:用β-磷酸甘油制备钙化的大鼠血管平滑肌细胞,再以血管紧张素-(1-7)、血管紧张素Ⅱ、血管紧张素Ⅱ 血管紧张素-(1-7)、选择性蛋白激酶A(PKA)或蛋白激酶C(PKC)抑制剂等干预,通过Von Kossa染色及检测钙含量、碱性磷酸酶活性、骨钙素浓度和Cbfa1 mRNA表达来探讨血管紧张素Ⅱ对钙化的影响及其信号通道。结果:血管紧张素-(1-7)抑制钙化大鼠血管平滑肌细胞的钙含量、碱性磷酸酶活性(P>0.05)、骨钙素浓度和Cbfa1 mRNA表达(P<0.05),也抑制血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞的钙含量、碱性磷酸酶活性、骨钙素浓度和Cbfa1 mRNA表达的促进作用(P<0.05);血管紧张素-(1-7)提高血管平滑肌细胞内cAMP浓度(P<0.05),PKA抑制剂可阻断血管紧张素-(1-7)对钙化血管平滑肌细胞的钙含量、碱性磷酸酶活性、骨钙素浓度和Cbfa1 mRNA表达的抑制作用(P<0.05)。结论:血管紧张素-(1-7)可抑制β-磷酸甘油诱导的血管平滑肌细胞钙化,并拮抗血管紧张素Ⅱ促进的血管平滑肌细胞钙化;这些效应与cAMP-PKA-Cbfa1信号途径有关。     

中国92例HIV/AIDS患者HIV-1 gp41 2F5和4E10中和抗体表位变异研究

目的 探讨92例HIV/AIDS患者HIV-1病毒近膜端(membrane proximal external re-gion,MPER)中和抗体2F5和4E10保守表位ELDKWA、NWFDIT氨基酸变异特点,为中国HIV/AIDS患者免疫治疗以及疫苗设计提供数据.方法 Nest-PCR扩增HIV-1 env区gp41段基因,核酸序列测定,翻译为氨基酸与HIV-1 Sequence Database HXB Ⅱ参考株中和抗体表位数据比对,分析2F5、4E10中和表位氨基酸变异情况.结果 92例HIV/AIDS患者HIV-1外膜蛋白env gp41段中和抗体2F5、4E10保守表位氨基酸均存在突变;2F5中和抗体表位主要有E662A(14.1%)、K665S(17.4%)、A667K(16.3%)突变;4E10中和抗体表位主要有N671S(13.0%)、D674S(3.3%)、T676S(16.3%)突变;CRF_B'C亚型与B'亚型的2F5和4E10表位氨基酸突变差异具有统计学意义(P<0-05);CRF_B'C与CRF01_AE亚型2F5表位突变差异具有统计学意义(P<0.05);B'亚型缓慢进展者、HIV感染者和AIDS患者的4E10表位氨基酸突变差异具有统计学意义(P<0.05).结论 92例HIV/AIDS患者HIV.1包膜蛋白env gp41段中和抗体2F5、4E10中和表位氨基酸存在突变,且变异多样化;不同亚型中和抗体保守表位氨基酸位点变异有差异;B'亚型4E10中和抗体表位变异可能与疾病进展有一定联系.     

桑色素对小鼠T淋巴细胞体外活化、增殖和细胞周期的影响

目的:研究桑色素(morin)对小鼠T淋巴细胞活化、增殖和细胞周期的影响。方法:以刀豆蛋白A(ConA)刺激培养的淋巴结来源的小鼠淋巴细胞,再以不同终浓度的morin与T细胞共培养,利用流式细胞术(FCM),检测早期T细胞活化的标志CD69分子的表达,以羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰脂(CFDA-SE)染色检测T细胞的增殖;以碘化丙锭(PI)染色分析T细胞的细胞周期。结果:小鼠T细胞培养6 h后,未经ConA刺激的对照组中CD69 T的细胞比率为(2.97±0.12)%,经ConA刺激的CD69 T细胞的比率明显增高,达到(72.52±0.66)%,与对照组相比差别明显(P<0.01)。终浓度为25、50、100μmol/L的morin均下调CD69 T细胞的比率,其中,100μmol/L的morin抑制作用最强,为(48.95±0.81)%,与对照组比较具有统计学意义(P<0.01)。CFDA-SE染色分析显示,ConA组培养48 h和72 h的T细胞的增殖指数(PI)分别为(1.58±0.04)和(1.95±0.02),各浓度的morin对ConA刺激的T细胞增殖,具有明显地抑制作用,以100μmol/L的morin抑制作用最明显。培养48 h的ConA组T细胞的PI为(1.02±0.02)、培养72 h的ConA组T细胞的PI为(1.03±0.01),与相应时间的对照组比较,均有统计学意义(P<0.01)。PI染色后流式细胞术分析的结果表明,ConA组处于S期的T细胞的比率为(27.05±0.39)%,显著高于对照组的比率(5.10±0.07)%。morin组中S期的细胞比率较高。结论:Morin可显著抑制ConA刺激的T细胞活化及增殖;其对增殖的抑制作用主要表现为S期的细胞的阻滞。     

儿童呼吸道腺病毒基因分型方法的建立及其应用

目的 利用PCR技术,建立引起儿童呼吸道感染的腺病毒的基因分型方法,便于推广和应用.方法 分析GenBank中不同型别腺病毒的六邻体基因序列特点,设计不同型腺病毒的特异性引物,以PCR方法进行基因分型,建立基因分型方法,并利用此方法对广州市2004年7月某幼儿园流行的腺病毒感染进行了基因分型.结果 建立了呼吸道腺病毒的基因分型方法.广州市2004年7月某幼儿园流行的腺病毒为3型腺病毒.结论 PCR方法可进行腺病毒的基因分型,且简便、结果可靠,便于推广应用.     

Nestin、CK19及insulin等在胚胎胰腺发育中的表达

目的:研究Nestin、CK19、胰岛素、胰高血糖素及生长抑素在胚胎胰腺发育中的表达,探讨胰岛细胞分化发育的机制。方法:采用免疫组化SABC法及免疫组化双染法(LAB SA),对30例6～14wk人胚胎胰腺中,Nestin、CK19、胰岛素,胰高血糖素及生长抑素阳性的细胞进行定位。结果:(1)胚胎胰腺发育中Nestin阳性细胞存在于胰腺的间质,数量极少;CK19在胰腺导管上皮分化中持续表达,呈强阳性;(2)7wk胰腺导管上皮开始分化出胰岛细胞,胰岛素、胰高血糖素及生长抑素表达阳性,三者的表达并无时段差异性;随着胎龄的增加,阳性细胞数增加,14wk时胰岛逐渐形成,表达达到高峰。结论:胚胎胰腺的发育中,胰腺间质存在胰腺干细胞;胚胎早期胰腺导管上皮细胞开始分化并分泌胰岛素,其自分泌的激素可能参与调节胰岛细胞的迁移和胰岛的形成。     

不同胎龄的胎儿和少儿皮肤中bax,bcl-2和p53基因表达的变化

目的：探讨凋亡相关基因bax, bcl-2和p53在不同胎龄的胎儿皮肤和少儿皮肤组织中表达的变化特征及其可能的生物学意义。方法： 运用末端脱氧核糖转移酶介导的生物素化脱氧尿嘧啶缺口标记技术(TUNEL)检测18例不同胎龄(13-32周)的胎儿皮肤和6例少儿皮肤组织中细胞凋亡的变化后，提取这些皮肤组织中的总RNA，分离mRNA，用RT-PCR方法检测bax, bcl-2和p53基因在不同组织中的表达变化特征。结果： 随着胎儿的生长发育，皮肤组织中的细胞凋亡率逐渐增加。在早期妊娠胎儿的皮肤中，bcl-2基因表达水平较高，随着胎龄的增加，bcl-2基因的转录本含量逐渐降低，在少儿的皮肤组织中，这种基因的表达量明显低于早期妊娠胎儿皮肤（P<0.01）。与bcl-2基因不同，在早期妊娠胎儿皮肤组织中，p53基因表达水平较低，而在晚期妊娠胎儿和少儿的皮肤内，该基因表达较强，而bax基因在不同发育时期的胎儿和少儿皮肤组织中表达差异不显著（P>0.05）。结论： 晚期妊娠胎儿和少儿皮肤组织中细胞增殖减缓，细胞趋向分化或凋亡的增加可能与p53基因表达增强，bcl-2表达降低相关；而p53表达降低，bcl-2表达升高可能是早期妊娠胎儿皮肤中细胞凋亡较少的机制之一。     

Opa相互作用蛋白5在胰腺癌中的表达及其对PANC-1细胞增殖的影响

目的探索Opa相互作用蛋白5(OIP5)在胰腺癌中的表达及其对PANC-1细胞增殖的影响。方法通过数据库分析OIP5在胰腺癌组织及癌旁组织中的表达;用实时定量PCR(RT-qPCR)和蛋白印迹法(Western blot)分别检测人胰腺癌细胞系MIAPaCa-2、PANC-1、KP-3、BxPC-3细胞中OIP5 mRNA和蛋白表达;构建OIP5基因沉默质粒的慢病毒(pGCSIL-shOIP5)和对照质粒慢病毒(pGCSIL-shCtrl),分别感染PANC-1细胞,分为OIP5基因沉默组和shCtrl对照组,5 d后采用RT-qPCR和Western blot测定慢病毒敲低效率,流式细胞计量术检测细胞凋亡;OIP5基因沉默组和shCtrl对照组连续5 d进行MTT检测和细胞计数;OIP5基因沉默组和shCtrl对照组孵育10 d形成集落,Giemsa染色分别集落总数。结果胰腺癌中OIP5 mRNA表达显著高于正常胰腺组织(P<0.05),OIP5高表达患者的总存活率显著低于OIP5低表达患者(P<0.05),且其无病生存率也显著降低(P<0.05);OIP5在MIAPaCa-2、PANC-1和KP-3中表达较高,而在BxPC-3细胞系中的表达较低;MTT检测结果显示OIP5沉默在第4和第5天显著降低了PANC-1细胞的增殖速率(P<0.01);OIP5沉默后细胞集落数(平均为9个)显著低于shCtrl对照组中的数量(平均为40个)(P<0.01);OIP5沉默后PANC-1细胞凋亡比例为8.3%显著高于shCtrl的4.5%(P<0.01)。结论OIP5在胰腺癌细胞系中异常高表达,OIP5基因可调控胰腺癌PANC-1细胞的增殖、凋亡以及集落形成,提示OIP5可能在胰腺癌发病机制中作为癌基因发挥作用,从而为胰腺癌的靶向治疗提供了潜在的生物标志物。     

The affinity of anti-HBc antibodies in acute and chronic hepatitis B infection.

Antibodies to hepatitis B core antigen (anti-HBc) are found in the sera of all individuals infected with hepatitis B virus. A role for these antibodies has been suggested in determining the outcome of infection. In this study, the affinity of anti-HBc antibodies in asymptomatic virus carriers was compared with that of antibodies present in the sera of patients with chronic liver disease. Persistently infected individuals with no evidence of clinical disease were found to have anti-HBc antibodies of greater affinity, compared with the chronic liver disease group. Sera from patients with chronic hepatitis contained high levels of low-affinity antibody whereas antibody levels in asymptomatic carriers were significantly lower. These findings are discussed in relation to the predicted role of anti-HBc antibodies in mediating hepatitis B virus-related hepatocellular injury.