中枢神经系统不同部位来源的神经干细胞在体外生长特性的比较

目的 比较相同发育阶段中枢神经系统不同部位来源的神经干细胞在体外的生长特性。方法 胚胎小鼠(E14)于无菌条件下分别分离并收集皮层、纹状体、间脑、中．后脑和脊髓，各部分制备成单细胞悬液，接种在添加有纤维细胞生长因子(FGF)的无血清培养液内，神经干细胞克隆生成后，经免疫细胞化学方法鉴定细胞特性，并在相同条件下进行传代，相差显微镜下观察克隆生成和细胞的迁移特性。结果 在添加有纤维细胞生长因子的无血清培养液中，少量接种的单个细胞会增殖并形成悬浮于细胞培养液中的细胞克隆。这些克隆具有生成新克隆并分化成神经元和胶质细胞的能力。在相同发育阶段，皮层、纹状体、间脑均可生成悬浮的克隆，其中皮层生成的速度最快，纹状体、间脑较慢，中．后脑、脊髓生成克隆的速度最慢；生成克隆后，皮层克隆的贴壁能力最差，贴壁的克隆少有细胞从其底部迁出，纹状体、间脑克隆较易贴壁，贴壁克隆底部有明显的细胞迁出，中．后脑、脊髓生成的克隆不易悬浮，很快贴壁，在贴壁克隆的底部有大量的细胞迁出。结论 在无血清培养液中，神经干细胞可在体外增殖、传代并分化生成神经元和胶质细胞，不同部位来源的神经干细胞在体外生成克隆的速度和细胞迁移性不同，这可能同体内特定部位细胞的发育特性有关。     

氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:制备抗人氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定与应用.方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备 mAb,并通过间接ELISA法、Western blot、免疫组化及免疫荧光染色的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAP XR表达文库筛选鉴定抗原,借助免疫捕获的方法用抗体来分离复合物.结果:获得3株可稳定分泌抗人CPSI mAb的杂交瘤细胞系.mAb的Ig亚类(型)为IgGl(K),该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化、免疫荧光染色、免疫沉淀实验和复合物的分离.结论:成功制备了抗人CPSI的mAb,为CPSI的研究提供了有力的工具.     

B淋巴细胞刺激因子及其受体与多发性骨髓瘤关联性的临床实验诊断研究

目的:探讨B细胞激活因子(BLyS) 及其受体在多发性骨髓瘤(MM)发病中的作用机制.方法:用酶联免疫吸附测定法(ELISA)和实时荧光定量聚合酶链反应 (RFQ-PCR),对19例MM患者和30名健康人血清BLyS含量、外周血单个核细胞(PBMCs) 中BLyS及其受体mRNA 含量进行检测;并比较MM患者血清BLyS含量与外周血BLyS及其受体基因表达水平和免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)浓度、乳酸脱氢酶(LDH)、轻链(kap、lam)的相关性.结果:MM患者血清 BLyS含量[(7.95±4.93) g/L 明显高于健康对照组[(2.70±1.09) g/L,P<0.01 ,并与LDH浓度呈正相关性(r=0.734,P<0.001);97.4% (18/19),84.2% (16/19)的MM患者PBMCs中BLyS、BCMA mRNA表达水平较正常人明显增高,并且也与LDH的含量呈正相关;而47.32% (9/19)患者TACI mRNA表达水平降低.结论:MM患者的血清BLyS蛋白浓度和PBMCs中BLyS及其受体基因表达水平有异常改变,说明BLyS及其受体可能参与MM的发病;BLyS及其受体表达水平也许可作为预后的一个指标.     

人IL-1β重组表达载体在肝癌细胞的表达及对其NK细胞杀伤敏感性的影响

目的：构建全长人IL-1β真核表达载体,转染H7402肝癌细胞,分析对其NK细胞杀伤敏感性的影响。方法：RT-PCR法扩增人IL-1β基因全长编码序列,经T-A克隆,构建pIRES2-EGFP-IL-1β重组表达载体,采用阳离子聚合物jetPEI的方法转染H7402肝癌细胞,G418筛选获得稳定表达的细胞克隆,RT-PCR分析IL-1β的表达水平,MTT方法分析转染前后NK细胞对肝癌细胞杀伤活性的变化。结果：从LPS处理的人外周PBMCs总RNA中扩增出IL-1β（大小约829 bp）,先构建pMD18-IL-1β克隆载体,DNA序列鉴定正确后,利用Pfu DNA聚合酶将IL-1β基因亚克隆到pIRES2-EGFP中,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-IL-1β,经PCR、限制性酶谱分析（BamHⅠ和EcoRⅠ）和DNA序列测定正确后,将其转染H7402肝癌细胞,G418筛选获得稳定表达IL-1β的细胞,与转染空载体的细胞相比,该细胞对NK-92细胞杀伤的敏感性显著降低,效靶比10∶1时下降了约30%。结论：促炎性细胞因子IL-1β能够显著增强肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗性,可能是导致肝癌细胞发生天然免疫逃逸的重要机制。     

前脑缺血再灌流后大鼠海马 NMDA受体亚单位NR1蛋白的表达变化

目的　观察大鼠前脑缺血再灌流后海马各区域NMDA受体亚单位NR1表达的变化和差异 ,探讨NR1在缺血性脑损伤中的作用。　方法　免疫组织化学和图像处理技术。　结果　 1 在前脑缺血再灌流后早期 ,海马各区域NR1的表达水平显著下降 (P <0 0 5 )。CA1区 ,下降趋势持续存在且不可逆 ,直至再灌流后第 7d ,NR1在该区域的染色强度降至对照组的 17% (P <0 0 5 )。CA3区及齿状回 ,NR1的表达下降是可逆的 ,再灌流后 72h ,齿状回的表达恢复正常 ,再灌后第 7d ,CA3区的表达也恢复到对照组的 96 % ,两组间染色强度无显著差异。 2 在迟发性神经元坏死出现前的缺血再灌流的早期 ,NR1在CA1区、CA3区及齿状回表达下降的幅度不一致 ,再灌后 6h以前 ,CA1区的下降幅度明显小于CA3区及齿状回 (P <0 0 5 ) ,再灌后 12h ,CA1区的下降幅度仍低于CA3区 (P <0 0 5 )。结论　短暂性前脑缺血后 ,NR1在海马CA1区、CA3区及齿状回表达下降的幅度和可逆性存在显著差异 ,这种差异可能是造成CA1区缺血敏感性的重要原因。     

简易精神状态检查适用人群及影响因素

目的：根据简易精神状态检查（MMSE）在大样本人群中的测试结果分析，探讨MMSE的适应人群及影响因素。方法：通过随机整群分层抽样，对4921名55岁或以上的西安市城市居民进行MMSE测查。分析MMSE得分在不同年龄，不同文化程度以及总体人群中的第10百分数、中位数、偏度、峰度以及对痴呆的阳性预测值。并用多元逐步回归法分析MMSE得分的影响因素。结果：MMSE得分在不同年龄、不同文化程度、总体人群中都呈现负偏态，尖峭峰型分布。在年龄较轻（70岁以下）、文化程度偏高（初中或以上）的人群中偏性分布最明显，痴呆的检出率较低；而在年龄偏大（70岁以上），文化程度偏低（小学及以下）的人群中接近正态分布，痴呆的检出率较高。文化程度、年龄、性别、受教育年限、听力下降、日常生活能力对MMSE得分有显著影响（P＜0．001）。结论：MMSE量表最适用于年龄偏大（70岁以上），文化程度偏低（小学或以下）的人群，对痴呆的筛选能力大；而对于年龄偏小，文化程度偏高的人群，MMSE的鉴别筛选力较低。实践中应根据具体研究目的选用适宜量表，并灵活掌握分界值，以达到最大效益。     

管花苷B对抗H202诱导的PCI2细胞凋亡

目的:观察肉苁蓉提取物管花苷B对H:O:诱导的PCI2细胞损伤的影响.方法:用MTr法检测细胞存活率,以激光共聚焦显微镜荧光染色法检测细胞内活性氧的产生和线粒体膜电位的变化,DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测细胞凋亡的发生,并用荧光酶标仪测定caspase-3的活性.结果:100 μmol稬-1H2O2处理细胞24 h显著降低细胞的存活率;诱导细胞发生凋亡,凋亡率达48.O％;细胞内活性氧水平及caspase-3的活性显著升高;而线粒体膜电位却明显降低,红／绿荧光强度的比值由正常的5.97降低为0.41左右.而预先给予l、10或100 mg.L-1浓度的管花苷B处理细胞12 h,可显著提高细胞存活率;并可有效抑制DNA ladder的发生;流式细胞仪检测凋亡率分别降低到30.9％、18.3％和6.2％;激光共聚焦显微镜结果显示管花苷B可明显降低细胞内活性氧的水平;并可逐渐恢复线粒体的高能量状态;easpase-3的活性不断降低,并呈现了一定的剂量依赖性.结论:管花苷B能显著地抑制H2O2诱导的PCI2细胞凋亡,其神经细胞保护作用可能与其降低细胞内活性氧水平,维持线粒体膜电位的高能状态和抑制caspase-3的活性有关.     

管花苷B对抗H2O2诱导的PC12细胞凋亡

目的：观察肉苁蓉提取物管花苷B对H₂O₂诱导的PC12细胞损伤的影响。方法：用MTT法检测细胞存活率，以激光共聚焦显微镜荧光染色法检测细胞内活性氧的产生和线粒体膜电位的变化，DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测细胞凋亡的发生，并用荧光酶标仪测定caspase-3的活性。结果：100 μmol·L^-1 H₂O₂处理细胞24 h显著降低细胞的存活率；诱导细胞发生凋亡，凋亡率达48.0％；细胞内活性氧水平及caspase-3的活性显著升高；而线粒体膜电位却明显降低，红/绿荧光强度的比值由正常的5.97降低为0.41左右。而预先给予1、10或100 mg·L^-1浓度的管花苷B处理细胞12 h，可显著提高细胞存活率；并可有效抑制DNA ladder的发生；流式细胞仪检测凋亡率分别降低到30.9%、18.3%和6.2%；激光共聚焦显微镜结果显示管花苷B可明显降低细胞内活性氧的水平；并可逐渐恢复线粒体的高能量状态；caspase-3的活性不断降低，并呈现了一定的剂量依赖性。结论：管花苷B能显著地抑制H₂O₂诱导的PC12细胞凋亡，其神经细胞保护作用可能与其降低细胞内活性氧水平，维持线粒体膜电位的高能状态和抑制caspase-3的活性有关。     

早期鼠胚简化双针取样法

为建立早期胚胎活检的动物模型，以安全高效地开展人类的植入前遗传学诊断，应用显微操作技术，对发育到8细胞期的小鼠胚胎进行了透明带溶洞吸取单个卵裂球的研究。结果表明：简化组的胚胎活检时间显著缩短，而胚胎完整率及单个卵裂球的完整率与传统组无明显差别。对照和两实验组胚胎在体外培养过程中均出现不同程度的胚胎发育延迟现象。活检后胚胎桑椹胚的发育率较对照组显著降低，但三组胚胎的出生率和生后三周仔鼠的体重无显著性差别，提示简化组的胚胎活检是安全而高效的，因而为开展人类的早期胚胎活检提供了方法学的参考。     

联合利用嵌套缺失和酚筛选法构建和鉴定目的基因的缺失突变体

目的 介绍一种快捷、无突变的目的基因缺失体构建和鉴定方法.方法 用Mlu I 和 Sac I酶将GCLC/pGL3在GCLC基因与pGL3连接处切开,形成以GCLC端为3'凹端而pGL3载体端为3'凸端的线型载体.利用外切核酸酶Ⅲ从GCLC基因端(3'凹端)单向逐一切除GCLC基因上的核苷酸,并在不同的时间终止其反应以获得一系列的GCLC基因缺失体.将GCLC基因缺失体与pGL3载体自身环化构建成GCLC基因序列缺失体的pGL3报道载体.最后用酚抽提和凝胶电泳法粗略挑选出不同长度的GCLC/pGL3缺失突变体.结果 利用嵌套缺失法构建出各种长度的GCLC基因的缺失突变体,且不存在基因突变的现象.利用酚筛选法快速鉴定出29种不同长度的缺失突变体.结论 联合利用嵌套缺失和酚筛选法可以高保真而快速地构建和鉴定目的基因的缺失突变体.