端粒酶反义RNA转染促进膀胱癌T24细胞凋亡的研究

目的　探讨端粒酶反义RNA对膀胱癌T2 4细胞恶性表型的抑制及促进其凋亡的作用。　方法　采用脂质体转染法将转录出端粒酶反义RNA质粒导入膀胱癌T2 4细胞。应用PCR ELISA法测定转染后T2 4细胞的端粒酶活性 ;光镜、电镜、MTT及流式细胞术 (FCM )等方法观察端粒酶反义RNA对T2 4细胞生长及凋亡的影响。　结果　端粒酶反义RNA能显著抑制T2 4细胞的端粒酶活性 ,转染T2 4细胞后使其生长受到抑制。形态学观察 ,转染后T2 4细胞出现典型的凋亡现象。FCM检测发现G1期前出现凋亡峰。　结论　转染端粒酶反义RNA能抑制膀胱癌T2 4细胞的恶性表型 ,促进其凋亡     

CS3基因的克隆及结构分析

定居因子是产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的主要毒力因子之一。它在ETEC对肠粘膜上皮细胞的粘附过程中起着重要的介导作用。在已知的定居因子中,CFA/Ⅱ为优势血清型定居因子抗原之一,它由CS1、CS2和CS3三种组分所构成。其中CS3组分为CFA/Ⅱ阳性菌的共有抗原。本工作运用DNA体外重组方法克隆了CS3基因,并对其结构进行了分析。     

培养细胞分泌的血纤维蛋白溶酶原激活物的研究

建立了测定血纤维蛋白溶酶原激活物(PA)活性的溶解圈法。敏感性能测出0.01IU尿激酶(UK)活性。在0.02IU至1IU之间UK浓度的对数与溶解圈直径呈线性关系。本法操作简单、敏感、不需特殊仪器,尤其适用于同时检测多份低含量PA样品。本工作证明20种(25株)细胞中有5种能分泌UK,有5株人黑色素瘤细胞能分泌tPA。其中A549、IB-RS-1及LLCMK_2能分泌UK;MM96L、MM253及MM138能分泌t-PA为我们首次确定。     

纤溶酶原激活剂与单克隆抗体

纤溶酶原激活剂是治疗血栓疾病的主要药物。迄今研究较多的纤溶酶原激活剂有:链激酶、尿激酶和组织型纤溶酶原激活3种。它们都具有一定的溶血栓作用,但都存在不同程度的出血倾向。增强PA制剂的纤溶原特异性则是减少周身出血,提高溶血栓效果的主要途径之一。利用单抗导向纤溶作用或用基因工程方法构建高效特异的融合蛋白,为增强PA制剂的纤溶特异性开创了美妙的前景。     

应用微细胞检测克隆基因的表达

在遗传工程研究中,克隆基因表达的检测是一个重要环节。如果克隆的基因DNA,已知它编码某一特殊的蛋白或某种RNA时,可以应用放射免疫化学方法、与相应的RNA探针杂交检测法、测定某种酶的活性及通过适当宿主之互补功能突变株的方法来测定。但当克隆的基因其表达蛋白功能不清楚时,应用微细胞系统检测是一个较为理想的方法。微细胞是某些细菌的突变株在生长期间产生的,它具有细胞壁、细胞膜、核蛋     

人前列腺癌cDNA文库的构建和筛选

目的:PC1基因是与前列腺癌相关的新基因,在雄激素非依赖和转移的前列腺癌晚期细胞系C42中高表达。为了进一步研究PC1基因的功能及作用机制,构建C42细胞的cDNA文库,寻找与前列腺癌相关基因PC1相互作用的蛋白。方法:从前列腺癌细胞系C42中提取总RNA,进而分离poly(A)+RNA,用poly(A)+RNA进行反转录并以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(dT)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的PCR片段,以此同源臂为基础在酵母中实现同源重组。通过文库片段、线性化的pGADT7Rec和诱饵质粒pGBKT7PC1C共转化酵母AH109菌株,在文库构建的同时进行与PC1相互作用蛋白的筛选;或先将文库片段,线性化的pGADT7Rec转化AH109,再利用AH109和Y187两种酵母菌株的接合生殖进行筛选。最后用Far Western印迹方法进一步从体外论证了PC1蛋白可与自身相互作用形成二聚体。结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人前列腺癌cDNA文库,双链cDNA片段的长度大小范围为250～5000bp。共转化的效率为4.3×105,重组效率为1.9×106,筛选的克隆数为4.3×105。接合法筛选时的接合效率为32%,筛选的克隆数为1.0×106。筛选到4个与PC1蛋白相互作用的阳性克隆。从体外证明了PC1蛋白可形成二聚体。结论:此文库的多样性和库容量均符合筛选需求。可用于前列腺癌相关基因     

志贺氏毒素B亚单位基因的克隆与表达及其免疫保护作用的研究

本研究首次从野生的志贺氏Ⅰ型痢疾杆菌(简称志Ⅰ)克隆了志贺氏毒素基因,其表达量为野生株的16倍。经次级克隆获得无毒性而有保护作用的志贺氏毒素 B 亚单位在大肠杆菌的高效表达,B 亚单位被纯化至电泳纯,分别制备了 B 亚单位特异的多克隆和单克隆抗体,其研究深度达国际先进水平。对 B 亚单位作为口服苗的一系列条件进行深入研究,分别将 B 亚单表达在细胞周质、细胞表面、分泌至胞外和与 LacZ 融合,观察哪一种表达方式在小鼠内引起更好的免疫反应;采用了四种不同的启动子和二种克隆载体,探索了哪一类启动子和克隆载体适用于构建口服苗。结果表明,中等强度、不需诱导和体内诱导的启动子和 pBR322是构建     

Smad3基因缺失加快的小鼠皮肤创面收缩速度机制研究

目的：研究Smad3基因剔除小鼠皮肤创伤愈合速度加快的机制。方法：利用不同基因型的Smad3基因剔除小鼠及对照小鼠进行皮肤缺失型创伤试验，观察组织病理变化；分离不同基因型小鼠胚胎成纤维细胞，观察其胶原收缩能力的变化。结果：Smad3基因剔除小鼠在皮肤创伤愈合时表现出重上皮化进度快；成纤维细胞胶原收缩试验中，Smad3缺失的细胞在有血清的培养条件下胶原收缩速度快于野生型细胞。而在无血清培养条件下，有无转化生长因子β1(TGF-β1)两者变化不显著。有血清培养时Smad3缺失的成纤维细胞表达α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)增加。结论：SMAD3通过抑制α平滑肌肌动蛋白在成纤维细胞中的表达调节成纤维细胞的收缩能力，以致Smad3缺失小鼠皮肤创面收缩速度加快。     

血清β-人绒毛膜促性腺激素和孕酮联合测定用于异位妊娠早期诊断的临床意义

目的评价血清β-人绒毛膜促性素激素(β-HCG)和孕酮(P)联合测定早期诊断异位妊娠临床意义。方法回顾性分析2008年9月至2010年9月在我院就诊的异位妊娠患者103例和正常妊娠的150例女性血清β-HCG、孕酮水平比较,探讨β-HCG与孕酮联合测定对异位妊娠的诊断价值。结果 A组患者血β-HCG测量值显著低于β组(P<0.01)。A组患者孕酮测量值显著低于B组(P<0.01)。结论目前诊断异位妊娠的方法虽日趋完善,但早期诊断仍有困难。