不同荧光定量PCR对于HBVcccDNA水平的检测差异对比

目的：研究对比不同荧光定量聚合酶链反应PCR对于乙型肝炎病毒HBVcccDNA水平的检测差异。方法选择20例从2007—2008年在广州市第八人民医院接受住院治疗的乙肝患者作为研究对象。提取其血清及肝组织进行实验分析,另取2份不含HBV感染的患者血清和肝组织作阴性对照组。将其中经或未经脱氧核糖核酸酶DNase处理的样本分别使用HBVc-ccDNA跨单缺口PCR和跨双缺口PCR检测。分析TaqMan探针跨单缺口PCR测定HBVcccDNA的结果,对比跨单、双缺口PCR测定结果以及不同荧光定量PCR的测定结果。分析血清和肝组织中HBVDNA与HBVcccDNA病毒载量的关系。结果血清及肝组织经过DNase消化后的有关拷贝数显著低于未消化者。血清和肝组织跨双缺口PCR测定结果较跨单缺口PCR测定结果均显著降低。血清中的HBVDNA及cccDNA实验结果均显著低于在肝组织中的测定结果,差异均有统计学意义（均P＜0．05）。阴性对照组经四种荧光定量PCR检测后均呈阴性。20例E抗原呈阳性的乙肝病人,其机体病毒载量总体趋势为血清HBVDNA的载量较肝组织更低,差异显著。结论 DNase 可有效减少 HBVcccDNA 在检测过程中的假阳性情况,经DNase处理后的跨双缺口PCR检测特异性最高。同时,血清中基本不含cccDNA。     

标本溶血对丙肝抗体IgG检测的影响

在临床检验中，时常遇到有溶血的标本，笔者用机械溶血方法，对照检测了溶血和非溶血标本的丙肝抗体队抗一IICVIgh），现将结果报告如T。1临床资料1．且样本：52例血液标本取自广州市第八人民医院就诊病人，抽取静脉血3ml，凝固后离心分离部分血清标本；后再用机械法造成溶血，离心后取其溶血血清。另在抗一HCVIgh常规检测中，留取10份OD值在临界值附近的血清及机械溶血后离心取其溶血血清。1．2试剂：抗一HCVIgh试剂盒由深圳月亮湾生物工程公司提供，批号对08（X，有效期内使用，操作方法按试剂盒说明书进行。1．3仪器：SLTABINS…     

芯片电泳快速检测乙型肝炎病毒YMDD变异

目的利用芯片电泳高分辨力和分析快速的优点,建立一种基于芯片电泳的乙型肝炎病毒YMDD耐药性突变的检测方法。方法利用序列特异性PCR联合芯片电泳检测乙型肝炎病毒YMDD变异;将YVDD、YIDD标准质粒分别按梯度稀释108～100进行检测,将105拷贝/μl YVDD、YMDD质粒及YIDD、YMDD质粒分别按99∶1、50∶50、20∶80、10∶90、5∶95、1∶99混合检测,评价该方法的灵敏度;用芯片电泳法检测86份经拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者血清样品中YMDD突变情况,并将其结果与荧光定量PCR比较;两种方法结果不一致的标本进行DNA测序鉴定。结果芯片电泳法能够在3 min内实现HBV YMDD变异检测,标准YVDD、YIDD质粒的检测限均为101拷贝/μl;不同比例(V∶M或I∶M)的混合质粒,最小比例突变检测率YVDD为5.0%,YIDD为10.0%;在86份标本中,芯片电泳检出总变异65份,突变率为75.6%,其中YVDD变异32份、YIDD变异23份、YVDD+YIDD混合变异为10份,荧光定量PCR检出总变异62份,突变率为72.1%,其中YVDD变异30份、YIDD变异29份、YVDD+YIDD混合变异为3份,两种方法检测结果差异无统计学意义(Kappa=0.609);两种方法检测结果不一致的标本20份,经测序结果显示,YMDD野生株6份、YVDD变异7份、YVDD+YIDD混合变异7份。结论芯片电泳法检测YMDD变异具有简单、快速、灵敏度和准确度高的优点,适合于临床实验室开展乙型肝炎病毒YMDD变异的检测。     

艾滋病毒1型感染者外周血T细胞和B细胞及NK细胞亚群分析

目的 检测和分析不同进展阶段的HIV-1感染者外周血T细胞、B细胞和NK细胞亚群变化.方法 用全自动血液分析仪和流式细胞仪分别检测253例HIV-1感染者血常规和外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD19+B细胞、CD16+CD56+NK细胞亚群,其中CD4+T细胞数超过500个/μL 37例(A组),在200～ 500个/μL之间的152例(B组),低于200个/μL 64例(C组).对照组为40例排除HIV、HCV、HBV感染的健康人(N组).多组比较采用单因素方差分析.结果 A、B、C三组中,CD4+T细胞数越低的组,淋巴细胞占白细胞的百分比和总淋巴细胞数也越低,且差异均有统计学意义(PABCN＜ 0.01).HIV 感染A、B、C组CD3+T细胞、CD3+ CD8+T细胞、CD19+B细胞占淋巴细胞的百分比均高于对照组(PAN＜0.05,PBN＜ 0.01,PCN＜ 0.01);CD4+T细胞数越低的组,CD3+T细胞、CD3+ CD8+T细胞和CD19+B细胞绝对计数也相应越低,各组相比差异有统计学意义(PABCN＜ 0.01).A、B、C三组CD16+CD56+NK细胞占淋巴细胞的百分比与NK细胞绝对计数变化呈相反趋势,CD4+T细胞数越低的组,CD16+ CD56+ NK细胞百分比越高,而其绝对计数越低,且CD16+ CD56+ NK细胞占淋巴细胞的百分比与NK细胞绝对计数均低于正常对照组水平(PABCN＜ 0.01).结论 HIV-1感染不仅影响人体细胞免疫,可能还影响人体的体液免疫和天然免疫.     

中国首例甲型H1N1流行性感冒二代病例分析

患者戴某,女,24岁,2009年5月28日因咽痛、咳嗽1 dA院.5月25日患者与广东省第3例输人性甲型H1N1流行性感冒(流感)病例李某有近距离接触,当天李某到婚纱影楼拍摄婚纱照,戴某为该影楼化妆师,当天下午李某与戴某及另一位化妆师薛某一同外出拍摄,薛某较戴某晚1 d被确诊为甲型H1N1流感病例.     

广东地区乙型肝炎病毒基因型研究

目的了解广东地区乙型肝炎病毒慢性感染者基因型。方法采用限制性片段长度多态性（RFLP）及序列测定法检测广东地区27例HBV携带者和173例慢性乙肝患者的HBV基因型。结果B型105例（52．5％）,C型94例（47％）,D型1例,未发现其他基因型。B型中ASC所占比例（18．1％）显著高于C型中ASC所占比例（8．5％）,χ^2=3．89,P〈0．05。C型中肝硬化所占比例（23．4％）显著高于B型中肝硬化所占比例（7．6％）,χ^2=8．46,P〈0．01。C型在ASC、慢性乙肝轻度、中度、重度及重型肝炎、肝硬化的比例依次增高,分别为29．6％（8／27）,35．5％（11／31）,44．2％（23／52）,45．8％（11／24）,52％（13／25）,71％（23／31）,提示广东地区C基因型与较重肝病有关。C型较B型年龄大。105例B型与94例C型无性别差异。结论广东地区HBV基因型有B,C,D型构成,以B型为主。C型较B型年龄大,与较重肝病有关。B,C型间无性别差异。     

基因芯片技术在乙肝病毒基因型及YMDD变异检测中的应用

目的评价基因芯片技术在HBV基因型及HBVP基因YMDD变异检测中的应用价值,并对不同基因型病例的临床情况进行分析。方法抽提HBV DNA,用PCR方法扩增S基因及P基因部分区域,扩增产物与基因芯片上的寡核苷酸探针进行杂交,杂交结果通过芯片影像读取仪扫描到计算机上,经软件分析可得到HBV基因型、HBVYMDD野生型及YVDD、YIDD变异型结果;部分标本通过HBV preS/S基因序列测序证实。结果38份高病毒滴度标本(HBV DNA定量>1.0×105拷贝/毫升)中22例为B基因型(58%),16例为C基因型(42%);32例为HBV YMDD野生型,2例为YVDD变异型、4例为YIDD变异型。临床情况方面,无症状携带者中有2例为基因型B、3例为基因型C,慢乙肝患者中有16例为基因型B1、2例为基因型C,肝硬化患者中有4例为基因型B、1例为基因型C;B型和C型患者e抗原阳性率分别为54.5%(12/22)和87.5%(14/16)。10份HBV DNA定量<1.0×105拷贝/毫升的标本不能检测出HBV基因型及YMDD变异情况。11例阳性标本的基因测序结果与基因芯片检测结果一致。结论(1)基因芯片检测HBV基因型及HBV P基因区YMDD变异准确性高、特异性好,同时每次实验得到的信息量多,适合于临床开展应用,但需提高灵敏度;(2)C基因型乙肝患者HBV e抗原阳性率高于B型患者。     

时间分辨荧光免疫法乙型肝炎病毒e抗原定量测定试剂盒的研制与性能评价

目的 对自研时间分辨荧光免疫法(TRFIA)乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)定量测定试剂盒进行性能评价.方法 2株单克隆抗体分别用于固相包被和铕标记,固相双抗体夹心二步分析法检测人血清HBeAg,并对自研试剂盒线性范围、精密度、分析灵敏度、特异度等进行评价,与对照试剂盒平行检测1 020例样本,检验结果采用线性回归分析,一致性采用Kappa检验.结果 自研试剂盒线性范围为0.60～160 NCU/mL,相关系数达0.99,批内和批间变异系数均小于10%,灵敏度达0.05 NCU/mL,检测国家标准物质或自制参考品的效价比为0.90～1.10,检测国家参考品符合国家的质量检定标准,37 ℃恒温箱烘烤6 d后检测性能无明显改变,与同类试剂检测结果线性相关系数达0.95,临床研究试验总符合率达100%,Kappa指数为1.结论 自研试剂盒精密度好、灵敏度高、准确性好、线性范围宽、符合率高,可取代对照试剂盒,值得推广应用.     

2009H1N1流感病毒神经氨酸酶基因克隆与表达

目的制备2009H1N1流感病毒神经氨酸酶（NA）重组蛋白,为建立H1N1快速检测方法和神经氨酸酶抑制剂筛选模型奠定基础。方法采用MDCK细胞方法分离2009H1N1流感病毒,提取病毒RNA,RT-PCR生成NA基因,构建原核表达载体PET-102/D-TOPO-NA,IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳、WersternBlotting鉴定重组蛋白。结果成功分离2009H1N1流感病毒,NA蛋白119、152、275、292位氨基酸分别为Glu、Arg、His和Cys。SDS-PAGE凝胶电泳蛋白分子相对分子质量约为64000,与预期一致。WesternBlotting证实该蛋白具有神经氨酸酶抗原活性。结论 IPTG诱导原核表达神经氨酸蛋白的最适浓度为0.1mmol/L。实验得到的蛋白尚需进一步纯化。     

血清中HBV cccDNA定量检测方法的建立及临床应用

目的 建立一种以TaqMan为探针检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）的实时定量PCR检测方法。方法 根据rcDNA与cccDNA结构差异,在缺口两侧设计引物,应用TaqMan探针分析,对实时PCR产物进行克隆、测序以证实产物为目的片段;同时对89例符合病毒性乙型肝炎诊断标准的血清样本进行HBV cccDNA和HBV DNA含量检测,3例未感染乙肝病毒的血清作为阴性对照。结果 测序结果显示扩增产物为目的片段,检出下限为500 copies/mL;89例样本检测HBV cccDNA的阳性率为55.0%,HBeAg阳性患者阳性率为67.8%,HBeAb阳性患者阳性率为30.0%,HBeAg阳性的样本的平均HBV cccDNA水平高于HBeAb阳性的样本（P<0.05）,阴性对照组未检测出HBV cccDNA。应用ROC曲线图评价HBV cccDNA在抗病毒治疗中的价值,其价值为0.927。结论 以TaqMan为探针检测血清HBV cccDNA的实时PCR检测方法的建立,具有快速、敏感、特异性高等特点,应用该方法检测HBV cccDNA含量可作为判断临床抗病毒治疗效果的重要参考指标,指导临床用药。