乙型肝炎病毒全基因组PCR扩增产物的直接测序

目的建立乙型肝炎病毒全基因组PCR扩增产物直接测序的方法并对序列进行分析。方法PCR法扩增乙型肝炎病毒全长基因,PCR扩增产物纯化后直接进行DNA序列测定;将已测定序列的PCR扩增产物用上述方法进行再测序以评价该方法的保真性;应用进化树分析及对齐比较等方法分析HBV基因型和YMDD变异情况。结果20例标本中有18例扩增阳性并得到全长基因组序列;保真性分析表明,本法引起的人为核苷酸突变率约为1‰;序列分析表明,18例标本中有10例为基因型B、8例为基因型C;2例出现耐拉米夫定的YMDD变异,均为基因型C。结论乙型肝炎病毒全基因组PCR扩增产物直接测序,方法简便,可满足临床和科研的需要。     

长期不进展人类免疫缺陷病毒-1感染者准种膜蛋白V3环氨基酸特点分析

目的 了解长期不进展HIV-1感染者HIV-1准种膜蛋白V3环氨基酸序列特征及变异特点.方法 应用终点有限稀释套式PCR方法,对5例长期不进展HIV-1感染者不同时间点单个HIV-1前病毒env基因c2-v3-c3区域进行扩增和序列测定,用序列确证分析技术分析env基因区V3环氨基酸序列特征.结果 5例患者不同随访时间点获得的准种序列中,V3环35个氨基酸中出现多样性的位点分别有1～10个不等,同一患者不同随访时间点准种优势株序列完全一致或仅有1～2个位点不同;4例患者V3环顶端四肽为GPGR,1例患者为GPGK,同一患者不同随访时间点V3环顶端四肽一致;根据V3环11和25位氨基酸及V3环的电荷推测HIV-1辅助受体均为趋化因子受体(CCR)5.结论 长期不进展HIV-1感染者V3环序列存在不同程度变异,顶端四肽稳定性高,感染的HIV-1毒株可能为非合胞体诱导型毒株.     

2009年广东省甲型流行性感冒暴发流行期间首株甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素基因分析

目的 检测和分析2009年广东省甲型流行性感冒(流感)暴发流行期间首株甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因.方法 对2009年广东省首例确诊的甲型H1N1流感患者的咽拭子进行病毒分离,取细胞培养上清液提取病毒核酸,采用HA基因的特异性引物进行RT-PCR,PCR产物进行克隆、测序和同源性分析.结果 获得2009年广东省首株甲型H1N1流感病毒的HA基因,大小为1710 bp,命名为A/GuangzhouSB/01/2009(H1N1)HA,GenBank登录号为GQ268003.与疫情发源地近期报告的277株甲型H1N1流感病毒的HA基因比对,同源性为99.0%～99.8%;其中与美国报告的病毒株的同源性高达99.8%,与患者发病前曾到美国旅游的流行病学史一致.与25株中国季节性甲型H1N1流感病毒的HA基因比对,同源性为72.3%～85.6%.结论 2009年广东省甲型流感暴发流行期间首株甲型H1N1流感病毒与目前流行的甲型H1N1流感病毒同源性高,与中国季节性甲型H1N1流感病毒同源性较低.     

用套式聚合酶链反应检测乙型肝炎疫苗免疫后无抗体反应者血清HBVDNA

为了解乙型肝炎（乙肝）疫苗接种后不产生抗－ＨＢｓ的原因，作者用套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测了正常人群中乙肝疫苗免疫后１５例不产生抗－ＨＢｓ和２０例产生抗－ＨＢｓ者血清的ＨＢＶＤＮＡ，同时用Ａｂｂｏｔｔ试剂检测血清的ＨＢｅＡｇ。结果发现，不产生抗－ＨＢｓ的１５例中有６例（４０％）第２次ＰＣＲ扩增ＨＢＶＤＮＡ为阳性，其中３例（５０％）为ＨＢｅＡｇ阳性，产生抗－ＨＢｓ者的２０例其血清ＨＢＶＤＮＡ和ＨＢｅＡｇ均为阴性。提示：常规方法漏检的低水平ＨＢＶ感染可能是造成乙肝疫苗免疫后不产生抗－ＨＢｓ的原因之一。     

广州地区肝炎患者血清中庚型肝炎病毒核酸检测和病毒核苷酸测序

目的 了解广州地区肝炎患者中庚型肝炎病毒（HGV）的感染情况及基因型特点。方法 采用逆转录－套式聚合酶链反应（RT－nested PCR)方法检测出肝炎患者血清中HGV RNA,引物位于HGV基因组的非编码区,并对扩增产物进行直接测序。结果 251例急慢性肝炎血清中共检出25例HGV RNA阳性,总阳性率为9．96％,其中56例非甲－戊型肝炎中要出4例阳性（7．14％）,77例乙型肝炎（HB）中检出8例阳性（10．39％）,118例丙型肝炎（HC）中检出13例阳性（11．17％）;2株HGV广州核苷酸之间的同源性为98．0％,与非洲洲的同源性分别为81．7％和84．2％,与美国株的同源性均为91．1％。结论 广州地区肝炎患者中存在HGV感染,2株HGV广州株可能为同一基因型,且与HGV美国株具有较高的同源性。     

应用巢式RT-PCR扩增HA和NA基因片段并测序鉴定甲型H1N1流感病毒

目的 建立一种利用巢式RT-PCR特异扩增HA和NA基因片段并测序鉴定甲型H1N1流感病毒的技术.方法 设计两套共7条特异引物,通过巢式RT-PCR分别扩增甲型H1N1流感病毒HA和NA基因片段并测序,所得序列与人感染甲型流感病毒主要HA和NA亚型序列进行进化树分析以对结果作进一步鉴定,蛋白序列比对后分析其特征.结果 4例甲型H1N1流感患者流感病毒HA和NA基因RT-PCR扩增均分别得到442 bp和543 bp片段产物.核苷酸序列进化分析表明,该4例患者HA和NA序列分别与2009年爆发的甲型H1N1流感病毒HA及NA序列聚集在一起,与季节性H1、H2、H3、人禽流感H5亚型及季节性N1、N2、人禽流感N1亚型特异分开.蛋白序列分析表明,4例患者流感病毒HA蛋白裂解位点附近氨基酸序列均为PSIQSR↓GLF,不具有高致病性流感病毒的特性,NA蛋白第275位氨基酸为His,未出现H275Y的耐药变异.结论 本方法能特异扩增甲型H1N1流感病毒HA和NA基因片段,测序后可用于甲型H1N1流感病毒的进一步鉴定;同时,得到的序列也可用于流感病毒致病力及耐药性的分析.     

多聚人血清白蛋白受体的检测在乙肝病人中的临床研究

本室于1986年底建立了酶联免疫吸附试验检测多聚人血清白蛋白受体(PHSAR,下称“受体”)的方法。试验表明,本法有良好的特异性及重复性。1987年上半年对108例病毒性肝炎病人血清“受体”检测发现,①慢性HBV感染血清“受体”检出率最高;②急乙肝“受体”与病情、病程有关,是诊断急乙肝现症病人及判断预后的参考指标;③高浓度“受体”伴随着慢活肝病人高黄疸发生率及高SGPT的出现,高浓度“受体”的慢迁肝,TTT异常及发生率高,“受体”阳性的慢性HBV重叠甲肝感染病人,多具明显病毒复制和活跃的免疫反应,预后较差。     

不同荧光定量PCR对于HBVcccDNA水平的检测差异对比

目的：研究对比不同荧光定量聚合酶链反应PCR对于乙型肝炎病毒HBVcccDNA水平的检测差异。方法选择20例从2007—2008年在广州市第八人民医院接受住院治疗的乙肝患者作为研究对象。提取其血清及肝组织进行实验分析,另取2份不含HBV感染的患者血清和肝组织作阴性对照组。将其中经或未经脱氧核糖核酸酶DNase处理的样本分别使用HBVc-ccDNA跨单缺口PCR和跨双缺口PCR检测。分析TaqMan探针跨单缺口PCR测定HBVcccDNA的结果,对比跨单、双缺口PCR测定结果以及不同荧光定量PCR的测定结果。分析血清和肝组织中HBVDNA与HBVcccDNA病毒载量的关系。结果血清及肝组织经过DNase消化后的有关拷贝数显著低于未消化者。血清和肝组织跨双缺口PCR测定结果较跨单缺口PCR测定结果均显著降低。血清中的HBVDNA及cccDNA实验结果均显著低于在肝组织中的测定结果,差异均有统计学意义（均P＜0．05）。阴性对照组经四种荧光定量PCR检测后均呈阴性。20例E抗原呈阳性的乙肝病人,其机体病毒载量总体趋势为血清HBVDNA的载量较肝组织更低,差异显著。结论 DNase 可有效减少 HBVcccDNA 在检测过程中的假阳性情况,经DNase处理后的跨双缺口PCR检测特异性最高。同时,血清中基本不含cccDNA。     

定量聚合酶链反应检测血清中HBV DNA及其临床应用

为探讨乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因含量与干扰素治疗效果的关系，采用信号引物能量转移定量ＰＣＲ方法，检测了２５例慢性乙型肝炎（慢乙肝）患者干扰素治疗前后的血清ＨＢＶＤＮＡ含量。结量显示，慢乙肝血清ＨＢＶ基因含量范围在１０４至１０１１拷贝／毫升之间；干扰素完全反应组治疗前血清ＨＢＶＤＮＡ含量（１０６．１３±２．４）显著低于（Ｐ＜０．０１）部分反应（１０７．８４±３．３）和无反应组（１０６．６８±４．８），表明血清ＨＢＶＤＮＡ含量与干扰素治疗效果有关，而与ＡＬＴ水平关系不明８显。研究结果提示定量检测ＨＢＶＤＮＡ是预测和评价干扰素治疗效果的重要指标之一。     

粪便中戊型肝炎病毒散发株的核酸序列分析

目的了解粪便中戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）散发株的核酸序列变异情况。方法用逆转录－套式－聚合酶链反应（ＲＴ－Ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）检测了８例广州地区散发性戊型肝炎患者粪便中的ＨＥＶＲＮＡ，３例阳性。对阳性ＰＣＲ产物的２３８个碱基进行了基因克隆和核酸序列分析，并与已报道的ＨＥＶ序列进行比较。结果本地区３株ＨＥＶ与缅甸株（Ｂ）、巴基斯坦株（Ｐ）、墨西哥株（Ｍ）、中国新疆株（Ｃｈ１．１）和广州血清株（Ｇ－９）的核苷酸和氨基酸的同源性均值分别为８０．６７％和８８．６０（Ｂ）、８１．２５％和８９．２０％（Ｐ）、７７．４５％和８４．８１％（Ｍ）、８１．２５％和８９．２０％（Ｃ）、９７．８５％和９６．２０％（Ｇ）。结论本组３株ＨＥＶ有一定程度的变异。