高雄激素PCOS动物模型中抗苗勒管激素Ⅱ型受体蛋白及其基因甲基化分析

目的通过建立高雄激素诱导的多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠模型,探讨抗苗勒管激素Ⅱ型受体(AMHRⅡ)在卵巢、子宫内膜中的表达及其基因启动子区域甲基化与PCOS发病及局部病理变化的关系。方法 45只雌性SD大鼠随机分两组:PCOS组皮下注射脱氢表雄酮(DHEA)建立PCOS模型,对照组同期皮下注射等量生理盐水;测定血清激素水平,结合卵巢组织HE染色切片结构改变评估PCOS模型;免疫组化法检测卵巢、子宫内膜组织AMHRⅡ蛋白的表达与定位;通过甲基化特异性PCR(MSP)定性分析两组大鼠血液、卵巢组织AMHRⅡ基因启动子区域的甲基化状态。结果血清性激素水平及卵巢切片结果均提示成功建立PCOS动物模型;免疫组化检测显示AMHRⅡ蛋白定位表达于细胞膜,在卵巢间质及卵泡颗粒细胞中均存在阳性表达,且在模型组中的表达强于对照组(P0.05);AMHRⅡ在子宫内膜中也存在表达,两组之间表达无统计学差异(P0.05);MSP结果显示两组中血液及卵巢组织所有DNA样本均检出部分甲基化条带,两组之间无统计学差异(P0.05)。结论 AMHRⅡ可能参与了PCOS中AMH调控卵泡发育的过程,但与子宫内膜病变无明显相关性;AMHRⅡ基因在启动子区域存在着部分甲基化,但这种甲基化状态与PCOS发病及局部组织病理变化无明显相关。     

广州市白云区流动人口育龄妇女HPV感染及宫颈病变的流行病学调查

目的了解广州市白云区流动人口育龄妇女人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染现状和流行病学特征,探讨HPV感染与不同宫颈病变的相关性。方法采用原位杂交法对4288名育龄妇女进行HPV-DNA检测,对宫颈肉眼观异常者作阴道镜检查并在病变处行活组织检查,行病理检查确诊。结果 4288名受检对象中,HPV感染率为7.9%,4个不同年龄组HPV感染率分别为11.3%、7.8%、5.1%、6.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。不同性生活年限HPV病毒的感染率分别为7.6%、7.7%、8.2%、7.9%、8.3%、8.0%、7.1%,差异无统计学意义(P>0.05)。宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)级别Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及宫颈癌中HPV检出率分别为60.1%、87.8%、93.0%、100.0%,与正常对照相比,其近似值差异率(odd ratio,OR)分别为7.1、43.6、52.6、75.1。不同年龄组CINⅠ的患病率分别为1.7%、2.0%、2.9%、4.7%,CINⅡ的患病率分别为0.8%、1.1%、3.2%、4.7%,CINⅢ的患病率分别为0.3%、0.4%、1.5%、2.7%,宫颈癌的患病率分别为0%、0.1%、0.5%、0.6%,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论广州市白云区流动人口育龄妇女的HPV感染主要分布在19～29岁人群,性生活年限为21～25年的感染率较高,50～59岁年龄段的人群宫颈病变的患病率最高。HPV感染与宫颈癌的发生密切相关,HPV感染是宫颈癌发生的高危因素,宫颈病变越严重,HPV检出率越高。     

左归丸对免疫性卵巢早衰小鼠卵巢GDF-9、BMP-15表达的影响

目的 明确促卵泡发育的卵巢卵母细胞自分泌因子生长分化因子-9(GDF-9)、骨形态发生蛋白-15(BMP-15)的表达不足在免疫性卵巢早衰发病中的重要作用,进一步阐明补肾活血中药复方左归丸通过调节卵母细胞自分泌因子的表达,对卵巢起到保护作用.方法 建立小鼠免疫性卵巢早衰模型:以小鼠透明带3所合成透明带多肽为免疫原.以出现动情周期紊乱、卵巢细胞受损,表示造模成功.然后将造模成功的小鼠随机分为模型组、左归丸高、低剂量组,强的松组、己烯雌酚组和对照组,共灌胃给药4周.免疫组化法检测GDF-9、BMP-15蛋白的表达.结果 模型组与空白对照组相比,GDF-9蛋白表达水平下降,差异显著(P＜0.05),左归丸低、高剂量组及己烯雌酚组与模型组相比,GDF-9蛋白表达水平增加,差异显著(P＜0.05),与空白对照组相比,无显著差异.左归丸高剂量组GDF-9蛋白表达水平也较强的松组增加,差异显著(P＜0.05).模型组BMP-15蛋白表达水平较其余各组减少,但各组相比均无显著性差异(P＞0.05).结论 左归丸对卵巢具有保护作用,能促进卵巢GDF-9蛋白的表达,从而促进卵泡的发育.     

IVIG被动免疫治疗对原因不明复发性自然流产患者细胞免疫功能的影响——附56例报告

目的:探讨静脉滴注免疫球蛋白(IVIG)被动免疫治疗对原因不明复发性自然流产(URSA)患者机体细胞免疫的影响。方法:选择71例URSA患者,根据患者意愿分为IVIG治疗组56例和对照组15例,IVIG治疗组56例接受国产IVIG 10 g,每3周1次,妊娠后每月接受国产IVIG 1次,直至妊娠26～30周。对照组则未予IVIG治疗。观察两组妊娠结局。流式细胞仪分析IVIG治疗前后妊娠成功者和失败者体内IFN-γ+CD4+T细胞、IL-10+CD4+T细胞和NK细胞亚群比例变化。结果:56例患者经IVIG治疗后,妊娠成功率为86%(48/56),明显高于对照组的20%。IVIG治疗组中,妊娠成功者体内IFN-γ+CD4+T细胞、CD56+CD16+NK细胞亚群比例比治疗前明显下降(P均<0.01),IL-10+CD4+T细胞、CD56+CD16-NK细胞亚群比例比治疗前明显升高(P<0.01);而妊娠失败者IVIG治疗前后体内各细胞亚群比例无明显改变。结论:IVIG被动免疫治疗能调节URSA患者机体细胞免疫应答,有利于维持妊娠。     

两种方法建立多囊卵巢综合征大鼠模型的实验研究

目的:探讨脱氢表雄酮(DHEA)法与孕激素联合人绒毛膜促性腺激素(hCG)法建立的幼年雌性SD大鼠多囊卵巢综合征(PCOS)动物模型效果。方法:模型组Ⅰ44只SD大鼠用孕激素和hCG建模;模型组Ⅱ44只大鼠用DHEA建模,观察两组模型的稳态模型评估(HOMA)指数、其他主要指标及卵巢形态学改变,并与对照组Ⅰ、Ⅱ比较。结果:模型组Ⅰ和模型组Ⅱ失去规律动情周期的大鼠的比例分别为86.4和77.3;模型组Ⅱ体重低于对照组(P<0.05),血清E2高于对照组;两建模组大鼠血清睾酮、空腹血清胰岛素、空腹血糖和HOMA指数均高于对照组(P<0.05);两模型组大鼠卵巢均可见多个扩张的囊泡。结论:两法制作的PCOS大鼠模型均获得成功,孕激素联合hCG法更为理想。     

FISH技术在诊断唐氏综合征及植入前遗传学诊断中的临床应用

目的:探讨优化现有荧光原位杂交(FISH)技术用于产前诊断唐氏综合征及其单细胞植入前遗传学诊断(PGD)的临床应用价值。方法:应用21号和X染色体特异性荧光素标记的双色混合探针对正常人体标本和25例唐氏综合征患儿外周血以及10例血清筛查阳性孕妇羊水进行FISH分析,同步进行羊水细胞培养,行常规细胞染色体核型分析,并以核型分析结果为金标准,建立一套稳定的FISH方法。在常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术方法基础上,用该方法分别对13例未受精卵、卵裂球进行唐氏综合征遗传学诊断。结果:正常羊水间期细胞和拟诊唐氏综合征羊水间期细胞经FISH分析,结果与染色体核型分析的结果一致,符合率100%。结论:建立的FISH方法具有快速、简便、准确性高、特异性强的特点,是快速进行产前唐氏综合征筛查及扩大PGD技术应用的简易可靠技术,有很好的临床应用价值。     

利用CRISPR/Cas9技术制备敲除AR和IRS2基因大鼠

目的探讨应用CRISPR/Cas9技术制备敲除雄激素受体(AR)和胰岛素受体底物2(IRS2)基因大鼠,构建可用于研究的稳定遗传的基因敲除大鼠品系。方法针对与雄激素表达相关基因-AR基因和胰岛素表达有关的胰岛素受体底物(IRS)基因设计出了20 bp的AR/IRS2 sgRNA和30 bp AR/IRS2 sgRNA,设计出的sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至SD大鼠受精卵细胞,F0代大鼠出生后取其基因组DNA测序鉴定基因型后,对确认敲除的大鼠F0与野生型交配,获得杂合子F1代。结果设计了20 bp AR/IRS2 sgRNA和30 bp AR/IRS2 sgRNA,与Cas9一起进行了体外转录后显微注射至SD大鼠受精卵细胞,共获得2个受精卵并移植到1只雌性代孕大鼠。繁殖出嵌合体大鼠F0 2只(#51,#56),F0#51、#56与野生型大鼠合笼,繁殖出F1大鼠9只,其中F0#51繁殖出3只为双敲大鼠(#12,#13,#18),其余6只为单敲大鼠,F0#51产生的3只双敲大鼠发生不同程度的碱基插入或缺失,其中#12,#18大鼠在AR基因上缺失7个碱基(CCCCGGC),在IRS2基因上缺失4个碱基(GCGC)。#13大鼠在AR基因上插入2个碱基(CG),在IRS2基因上缺失4个碱基(GCGC)。大鼠的AR、IRS2基因表达被破坏。结论采用CRISPR/Cas9技术成功获得敲除基因AR、IRS2大鼠,经基因测序和蛋白质免疫印迹鉴定AR、IRS2,证明正确,为下一步鉴定是否表现出多囊卵巢综合征表型特征打下基础。     

基因工程技术DNA多态性分析及应用

自１９８８年以来，本课题组应用基因工程技术对ＤＮＡ多态性进行分析，取得良好效果。这一技术避开了基因产物，直接研究遗传物质本身──ＤＮＡ的多态性，具有准确、分辨力高、不受基因表达过程影响因素干扰等许多优越性。在医学遗传学某些遗传病的诊断、基因连锁分析、疾病相关性分析、人类学、自身免疫性疾病、人类免疫调控、亲子鉴定和法医学个体识别等方面均具有广阔的应用前景。这些技术的实际应用已取得了明显的社会效益。     

CpG ODN增强免疫抑制小鼠对乙肝疫苗的免疫应答效果

环磷酰胺是肿瘤治疗中最常见的烷化剂 ,严重影响骨髓、胸腺和脾脏的功能导致患者免疫力低下 ,容易患各种感染性疾病 ,疫苗接种成功率也很低 ,因此 ,寻找有效疫苗佐剂来提高这群人的疫苗接种成功率具有重要的实际意义。近年来 ,大量的研究显示细菌DNA中存在非甲基化的CpG二核苷酸序列 (即CpG基序 )能激活免疫系统 ,诱导天然免疫应答分泌免疫球蛋白和各种细胞因子。人工合成含CpG基序的脱氧寡核苷酸 (CpGODN )与蛋白疫苗同时接种正常小鼠 ,能提高抗原特异性免疫应答 ,诱导出高水平保护性抗体。本实验应用CpGODN与乙肝疫苗同时肌肉注射…     

脐血CD4~+CD45~+调节性T细胞体外扩增及其抑制复发性流产患者免疫细胞功能研究

目的:建立有效的脐血CD4+CD45+调节性T(Treg)细胞体外培养体系,探讨其对复发性流产患者免疫细胞功能的抑制作用,为开发新的复发性流产免疫治疗方法奠定实验基础。方法:应用免疫磁珠分选法从脐血淋巴细胞中获得Treg细胞,体外进行长期培养、扩增,分别应用MTT法和51Cr释放法检测扩增后的Treg细胞对复发性流产患者效应T细胞和NK细胞功能的抑制作用;ELISA法检测Treg对复发性流产外周血Th1/Th2细胞因子的影响。结果:经过5、15、25天培养,Treg细胞的扩增倍数分别为(6.5±0.6)倍、(18.2±2.5)倍和(52.7±4.8)倍,Treg细胞的纯度分别为(93.2±3.4)%、(88.6±2.9)%和(81.9±3.3)%。培养25天后的脐血Treg细胞对复发性流产的CD4+CD25-效应T细胞和NK细胞杀伤活性具有明显抑制作用,能使外周血中IFNγ-水平下降,IL-10水平升高。结论:培养扩增后Treg细胞能在体外有效抑制复发性流产患者外周血免疫细胞功能,并能使外周Th1型细胞因子水平下降,Th2型细胞因子水平升高。